利用高能混合粒子場誘變選育高產Monacolin K、低產桔霉素的紅曲霉菌株

郎天丹，梁 健，王成濤，2，張 嬋，2，*，劉錄祥（.北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京00048；2.食品質量與安全北京實驗室，北京00048；.中國農業科學院作物科學研究所，國家農作物航天誘變技術改良中心，北京0008）

利用高能混合粒子場誘變選育高產Monacolin K、低產桔霉素的紅曲霉菌株

郎天丹1，梁 健1，王成濤1，2，張 嬋1，2，*，劉錄祥3
（1.北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京100048；2.食品質量與安全北京實驗室，北京100048；3.中國農業科學院作物科學研究所，國家農作物航天誘變技術改良中心，北京100081）

利用北京正負電子對撞機直線加速器E2束流打靶產生高能混合粒子場，以64.3 Gy的劑量處理兩株紫色紅曲霉（Monascus Purpureus）M1和M2，經初篩、復篩后采用HPLC法檢測誘變菌株中Monacolin K含量，并進行遺傳穩定性實驗，從而選育高產Monacolin K、低產桔霉素的突變株。結果表明：經混合粒子場輻照后，紫色紅曲霉M1和M2分別篩選出43株和22株正突變株，突變率分別為74.64%和56.72%，其中正突變率分別為60.56%和32.84%。突變株M1-20、M2-4發酵液中Monacolin K含量分別達到了421.69 mg/L和406.68 mg/L，較出發菌株分別提高了142.14%和101.27%，經5次傳代培養后產Monacolin K的能力僅下降了4.21%和1.65%，并且其發酵液中桔霉素的含量均在0.01～0.04 mg/L之間，與出發菌株相比，桔霉素含量均明顯下降。高能混合粒子場可引起紫色紅曲霉菌落形態及色澤發生改變，突變率高，可獲得遺傳性能穩定的突變株，是一種可應用到微生物誘變育種的新方法。

紫色紅曲霉，Monacolin K，混合粒子場，菌株選育

紅曲是一種廣泛應用于東南亞地區的傳統藥食同源的發酵產物，紅曲霉作為食用菌在中國已有上千年的歷史［1-2］。紅曲霉可產生多種次級代謝產物，主要包括紅曲色素［3-4］、Monacolin K［5-7］、γ-氨基丁酸［8-10］、麥角固醇［11］等。目前，Monacolin K已成為各國公認的降低膽固醇的理想藥劑［12-13］，對選育高產Monacolin K的紅曲霉菌株就顯得尤為重要。

空間環境誘變是微生物誘變育種的新途徑［14］，空間環境由于存在宇宙線粒子、高能重離子、高真空、極度溫差和弱磁場等因素可誘導微生物產生基因突變，進而影響微生物的生物學性狀和功能［15-18］。實踐證明，航天空間環境誘變微生物具有變異幅度大、頻率高、遺傳穩定性好等特性［19-20］。但由于空間實驗投資大，技術要求高，實驗機會也十分有限，空間誘變難以大規模、持續應用到微生物誘變育種中，所以要加強地面模擬航天空間環境誘變育種工作，這對于有效利用航天技術開展微生物誘變育種具有重要意義。近年來，中國農業科學院航天育種中心等單位率先在國內外利用北京正負離子對撞機模擬次級宇宙粒子，產生具有廣譜結構、能量在200 MeV～1.2 GeV之間的混合粒子場，主要應用于小麥、蔬菜、牧草等作物的改良上［21-22］。本研究利用北京正負離子對撞機模擬宇宙粒子組成的混合粒子場輻照處理紫色紅曲霉M1和M2來篩選高產Monacolin K、低產桔霉素的突變株，為紅曲霉的工業化生產提供新的理論依據，也為航天空間環境誘變技術在微生物誘變育種中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色紅曲霉M1和M2 本實驗室保存；葡萄糖、瓊脂、甘油 北京奧博星生物技術責任有限公司；甲醇、乙腈 賽默飛世爾科技（北京）有限公司，色譜純；Monacolin K（純度≥98%）、桔霉素（純度≥98%）

Sigma公司；其他試劑 均為國產分析純。

LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；HZQ-F160全溫振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠；恒溫水浴鍋 山東華魯電熱儀器有限公司；20A型高效液相色譜儀、UV-2450型紫外可見光分光光度計 日本島津公司；PHS-3D功能型pH計 上海三信儀表廠；超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司。

1.2 培養基

斜面培養基（g/L）：葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，酵母浸粉4 g，麥芽浸粉20 g，瓊脂20 g，KH2PO42 g，NaNO32 g，MgSO4·7H2O 1 g。

液體種子培養基（g/L）：葡萄糖30 g，豆粕粉15 g，蛋白胨10 g，甘油70 g，KH2PO42 g，NaNO32 g，MgSO4· 7H2O 1 g。

液體發酵培養基（g/L）：甘油90 g，大米粉20 g，蛋白胨10 g，KH2PO42.5 g，NaNO35 g，MgSO4·7H2O 1 g，ZnSO4·7H2O 2 g。

1.3 培養方法

單菌落接種試管斜面后，30℃培養7 d，至菌絲長滿斜面，用接種環刮取適量新鮮菌絲體接種到種子培養基中，30℃、200 r/min培養3 d，按10%（V/V）的接種量接種到發酵培養基中，25℃、150 r/min培養12 d。

1.4 實驗方法

1.4.1 紅曲霉孢子懸液的制備 將紅曲霉M1和M2斜面在30℃培養7 d后，用10 mL 0.9%的無菌生理鹽水將紅曲霉孢子洗滌下來，倒入已滅菌裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩約5 min，顯微鏡檢查，孢子分散即可。用已滅菌的帶有濾紙的漏斗過濾除去菌絲體，制成孢子懸浮液，并調整孢子濃度至105個/mL，4℃冰箱保存備用［23］。

1.4.2 紅曲霉的輻照處理 利用正負電子對撞機直線加速器E2束流打靶產生的混合粒子場（用CR表示）輻照處理兩株紫色紅曲霉的孢子懸液，輻照劑量為64.3 Gy。

1.4.3 誘變菌株初篩 將輻照處理的孢子懸液用0.9%的無菌生理鹽水做倍比稀釋，取10-1、10-2、10-3三個稀釋梯度的菌液100 μL涂于平板培養基上，30℃倒置培養3 d，初步篩選出菌落形態與出發菌株有明顯差異、生長較快或較紅的單菌落，接于試管斜面保存，用于下步實驗。對照組樣品做同樣處理［24］。

1.4.4 誘變菌株復篩 種子液培養：用接種環刮取適量新鮮培養好的試管斜面，接種到種子培養基中，30℃、200 r/min培養3 d。

液體發酵培養：按10%（V/V）的接種量將種子液接種到發酵培養基中，25℃、150 r/min培養12 d，檢測Monacolin K含量。

1.4.5 標準曲線的繪制 Monacolin K標準曲線的繪制：精密稱取Monacolin K標準品（內酯型）0.01 g，置于50 mL容量瓶中，加入4 mL甲醇溶液溶解，然后加20 mL 0.2 mol/L氫氧化鈉溶液，40℃超聲30 min后冷卻，用3 mol/L磷酸調節pH至6左右，加甲醇定容至刻度，即配制成濃度為200 mg/L酸型標準溶液，再分別稀釋成5、20、50、80、100、150 mg/L標準溶液。按照

1.4.6 中所述色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標（Y），Monacolin K質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。

桔霉素標準曲線的繪制：精密稱取桔霉素標準品0.001 g，置于50mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即配制成濃度為20 mg/L的標準溶液，再分別稀釋成0.05、0.2、2、4、8、12、16 mg/L標準溶液。按照1.4.7方法所述色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標（Y），桔霉素質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。

1.4.6 Monacolin K的檢測 發酵液的預處理：取發酵液5 mL，加入15 mL 75%的甲醇，超聲波萃取30 min，靜置過夜，然后取上清液經0.45 μm的有機微孔濾膜過濾，檢測濾液中Monacolin K含量。

Monacolin K的檢測［25］：采用HPLC法，色譜柱：InertsilODS-3 C18（150 mm×4.6 mm×5 μm），流動相：0.1%磷酸∶甲醇=1∶3，流速1 mL/min，檢測器為紫外檢測器（PDA），檢測波長237 nm，檢測溫度30℃，進樣量10 μL。

1.4.7 桔霉素的檢測 發酵液的預處理：取紅曲霉發酵液10 mL，加入20 mL無水乙醇，超聲破碎細胞10 min，60℃水浴振蕩1 h，冷卻至室溫，3000 r/min離心15 min，然后取上清液經0.45 μm的有機微孔濾膜過濾，濾液用來檢測桔霉素含量。

桔霉素的檢測［26］：采用HPLC法，色譜柱：YMCTriart C18（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相：乙腈∶水（磷酸調pH2.5）=35∶65，流速：1.2 mL/min，檢測器：熒光檢測器，激發波長λex=331 nm，發射波長λem= 500 nm，柱溫28℃，進樣量20 μL。

1.4.8 突變株的遺傳穩定性實驗 將篩選得到的相對高產Monacolin K、低產桔霉素的紫色紅曲霉誘變菌株在固體培養基上連續傳代5次，檢測各誘變菌株第5代的Monacolin K含量，研究其遺傳穩定性能，方法參見1.4.6。

1.4.9 突變株生物量的測定 干重法測定菌體生物量：取15 mL發酵液用3層紗布過濾，再用蒸餾水洗滌2～3次，擰干水分，在60℃烘箱中烘干至恒重，即為菌絲體干重［27］。

生物量（g/L）=干物質質量/發酵液體積

1.4.10 突變率的計算 誘變菌株突變率的計算以Monacolin K的含量為標準。將Monacolin K含量降低或提高20%以上的誘變菌株定義為突變株。正突變株即指Monacolin K含量提高20%以上的突變株。計算公式如下［28］：

突變率（%）=突變株數/總誘變株數

正突變率（%）=Monacolin K含量提高20%以上的突變株數/總誘變菌株數

負突變率（%）=Monacolin K含量降低20%以上的突變株數/總誘變菌株數

2 結果與分析

2.1 Monacolin K標準曲線

線性回歸方程：y=32768x+31956，R2=0.9992，證明Monacolin K在5～200 mg/L的范圍內線性關系良好。

2.2 誘變菌株初篩

圖1 誘變前（a）后（b）菌落形態Fig.1 Colony morphology before（a）and after（b）M1 mutagenesis

以紫色紅曲霉M1為例，a圖為輻照前孢子懸液（稀釋100倍）涂布平板后長出的菌落，b圖為輻照后孢子懸液（稀釋100倍）涂布平板得到的菌落。通過對比可知，經輻照處理后菌落數明顯降低，部分菌株的菌落直徑明顯小于出發菌株，菌落色澤呈現橙紅色，而部分菌株各個時期的菌落直徑均大于出發菌株相應時期的菌落直徑，其生長速度明顯快于出發菌株。因此，輻照處理后，初步篩選出菌落形態與出發菌株有明顯差異、生長較快或較紅的單菌落，接于試管斜面保存。

2.3 誘變菌株復篩

紫色紅曲霉M1初篩共得到71株誘變菌株，以Monacolin K含量為計算標準，得出紫色紅曲霉M1的突變率為74.64%，其中正向突變率為60.56%，負向突變率為14.08%，其中有12株突變株Monacolin K含量較高，與出發菌株相比提高了1倍以上，結果見圖2。紫色紅曲霉M2初篩共得到67株誘變菌株，突變率為56.72%，其中正向突變率為32.84%，負向突變率為23.88%，其中有5株突變株Monacolin K含量較高，4株與出發菌株相比提高了1倍左右，另外一株與出發菌株相比提高了2倍多，結果見圖3。

圖2 出發菌株M1與其突變株的Monacolin K產量Fig.2 The Monacolin K production of original strains M1 and its mutant strains

圖3 出發菌株M2與其突變株的Monacolin K產量Fig.3 The Monacolin K production of original strains M2 and its mutant strains

2.4 高產Monacolin K突變株產桔霉素的情況

2.4.1 桔霉素標準曲線 線性回歸方程：y=3263493x+49697，R2=0.9962，桔霉素在0.05～16 mg/L的范圍內線性關系良好。

2.4.2 突變株的桔霉素含量 將復篩得到的一些較出發菌株高產Monacolin K的突變株，參照1.4.7方法檢測各突變株產桔霉素情況，結果見表1。

由表1可見，各突變株產桔霉素能力相差不大，與出發菌株的桔霉素含量相比均下降了93%以上。故選擇Monacolin K含量較高、桔霉素含量相對較少的紅曲霉M1-20、M1-21、M1-23、M1-36、M1-40和M2-3、M2-4、M2-45、M2-46、M2-48突變株進行菌株的遺傳穩定性實驗。

表1 突變株產Monacolin K和桔霉素的情況Table1 Mutant strains produce Monacolin K and citrinin

2.5 突變株的遺傳穩定性實驗

為檢測突變株的遺傳穩定性，對篩選出的10株突變株連續傳代5次，采用HPLC法檢測突變株中Monacolin K含量。由圖4和圖5可見，紅曲霉M1-20、M1-21、M1-23、M1-36、M1-40和M2-3、M2-4、M2-45、M2-46、M2-48突變株經5次傳代培養后產Monacolin K能力分別下降了4.2%、65.1%、20.75、6.2%、80.7%和10.6%、1.65%、38.0%、33.8%、72.6%，其中M1-20和M2-4突變株遺傳性能比較穩定，Monacolin K產量相對較高，故選擇該菌株作為繼續研究的菌株。

圖4 紫色紅曲霉M1突變株傳代穩定性Fig.4 Monascus Purpureus M1 mutant subculture stability

圖5 紫色紅曲霉M2突變株傳代穩定性Fig.5 Monascus Purpureus M2 mutant subculture stability

2.6 突變株Monacolin K產量及生物量的測定

將遺傳穩定的突變株M1-20和M2-4搖瓶發酵，參照方法1.4.6和1.4.9分別測定突變株的Monacolin K產量和菌體生物量，出發菌株做同樣處理。如圖6和圖7所示，菌體生長基本符合S形生長曲線，菌體生物量在7 d左右達到最大值，且突變株M1-20和M2-4的生物量較出發菌株有一定提高。突變株M1-20和M2-4在4～5 d時開始積累Monacolin K，第6 d時Monacolin K積累進入對數期，速度明顯加快。Monacolin K主要在菌體生長的穩定期積累，且突變株M1-20和M2-4的Monacolin K產量明顯高于出發菌株，到第13 d時Monacolin K的合成量趨于穩定，此時部分細胞發生裂解死亡引起產量細微的波動。

圖6 突變株M1-20生物量及Monacolin K產量Fig.6 Biomass and Monacolin K yield of mutant M1-20

圖7 突變株M2-4生物量及Monacolin K產量Fig.7 Biomass and Monacolin K yield of mutant M2-4

3 結論

利用北京正負電子對撞機模擬宇宙粒子組成的混合粒子場輻照處理紫色紅曲霉M1和M2，通過觀察紅曲霉的菌落形態、HPLC法檢測Monacolin K和桔霉素含量、遺傳穩定性實驗來篩選穩定的高產Monacolin K，低產桔霉素的突變株，最終篩選出M1-20和M2-4兩株穩定高產的突變株。突變株M1-20、M2-4發酵液中Monacolin K含量分別達到了421.69 mg/L和406.68 mg/L，與出發菌株相比分別提高了142.14%和101.27%，其經5次傳代培養后產Monacolin K的性能僅下降了4.2%和1.65%，表現出良好的遺傳穩定性，可作為進一步研究的菌株。與傳統的誘變育種相比，混合粒子場誘變具有誘變作用強、誘變率高、變異幅度廣和有益變異多等優點，可從中獲得豐富的突變株，在提高誘變效率、提高紅曲霉生產潛力、改良品質方面起到理想的效果，特別是可從中獲得傳統育種難以獲得優質紅曲霉突變株。因此，高能混合粒子場已成為微生物誘變育種的新途徑。

［1］楊悅，王碩，杜欣軍，等.不同培養基對紫色紅曲霉發酵規律的影響［J］.食品科技，2014，39（8）：21-27.

［2］Shi Y C，Pan T M.Beneficial effects of Monascuspurpureus NTU 568-fermented products：a review［J］.Applied Microbiology &Biotechnology，2011，90（4）：1207-1217.

［3］Mapari S A.Fungal polyketideazaphilone pigments as future natural food colorants［J］.Trends in Biotechnology，2010，28（6）：300-307.

［4］張銳.紅曲霉液態發酵生產紅曲色素的工藝優化［J］.生物技術通報，2015，31（2）：187-195.

［5］Endo A.Monacolin K，a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species.［J］.Journal of Antibiotics，2000，32（8）：852-854.

［6］楊歡歡，胡中澤.紅曲菌的復合誘變及其固態發酵條件的優化［J］.食品科學，2012（11）：247-251.

［7］李滔滔，李小龍，張鳳琴.高產洛伐他汀紅曲菌株的誘變選育［J］.食品工業科技，2012，33（24）：246-248.

［8］Obata K，Ito M，Ochi R，et al.Pharmacological properties of the postsynaptic inhibition by Purkinje cell axons and the action of γ-aminobutyric acid on Deitersneurones［J］.Experimental Brain Research，1967，4（1）：43-57.

［9］何曉嬌，陳璨，周月婷，等.高產γ-氨基丁酸低產桔霉素紅曲霉（Monascusruber）突變子1047篩選與發酵特性研究［J］.微生物學雜志，2014，34（5）：38-43.

［10］張圓林，王昌祿，陳勉華，等.高產γ-氨基丁酸的紅曲霉菌株篩選及發酵條件優化［J］.食品科學技術學報，2014，32（5）：35-40.

［11］黃志兵，許楊，張泓，等.紅曲菌幾種主要次級代謝產物及其生物活性的研究進展［J］.食品與發酵工業，2010，36（4）：143-148.

［12］王璐.農桿菌介導轉化及原生質體融合法選育紅曲菌Monacolin K高產株［D］.無錫：江南大學，2011.

［13］李晶，馬貴民，馮曉明，等.紅曲霉發酵產物Monacolin K的研究進展與應用［J］.食品工程，2014（2）：9-11.

［14］胡延嶺，劉錄祥，郭會君，等.高能混合粒子場誘發的小麥矮桿突變體的SSR分析［J］.核農學報，2008，22（4）：399-403.

［15］俞法明，嚴文潮，毛雪琴，等.利用空間誘變技術進行早秈稻新品種的改良［J］.核農學報，2014，28（6）：949-954.

［16］董亞琳，張洪偉，代秀云.空間環境誘變育種技術及應用［J］.農業與技術，2010，33（3）：21-23.

［17］高桐梅，衛雙玲，李春明，等.芝麻太空誘變效應及AFLP標記檢測［J］.華北農學報，2013，28（1）：227-233.

［18］黃永相，郭濤，蔡金洋，等.空間環境和60Co-γ輻照對水稻稻米品質的誘變效應［J］.核農學報，2013，27（6）：709-714.

［19］趙金濤，郭新梅，裴玉賀，等.高能混合粒子場對玉米幼苗生長及抗氧化系統的影響［J］.核農學報，2014，28（12）：2133-2138.

［20］張文濤，杜久元，白斌.作物空間誘變及其在遺傳育種中的應用［J］.種子，2014，33（4）：48-52.

［21］于新玲，劉錄祥，喬利仙，等.高能混合粒子場輻照對花生胚小葉組織培養及植株再生的影響［J］.核農學報，2012，26 （3）：433-438.

［22］劉錄祥，韓微波，郭會君，等.高能混合粒子場誘變小麥的細胞學效應研究［J］.核農學報，2005，19（5）：327-331.

［23］李滔滔.高產洛伐他汀紅曲霉菌誘變育種及其在醬油廢水中的應用［D］.株洲：湖南工業大學，2013.

［24］印紅，謝申義，章光明，等.利用返回式飛船選育優良紅曲霉菌［J］.核農學報，2004，18（4）：297-299.

［25］胡文效，魏彥鋒，蔣錫龍，等.高產Monacolin K紅曲霉菌種的誘變選育及液態發酵工藝優化［J］.食品工業科技，2013，34 （24）：296-301.

［26］黃艷，孟麗茹，許贛榮，等.高產色素紅曲菌的選育及搖瓶發酵培養基優化［J］.中國食品添加劑，2013（6）：133-139.

［27］付海平.產Monacolin K紅曲霉的篩選及其發酵條件的研究［D］.長沙：湖南農業大學，2004.

［28］邱雯雯，任雅琳，陳存社，等.常壓室溫等離子體誘變篩選高乳糖酶活力酵母的研究［J］.中國食品學報，2014，14（2）：132-137.

Using high-energy hybrid particle field mutation breeding high yield Monacolin K and low yield citrinin of Monascus strains

LANG Tian-dan1，LIANG Jian1，WANG Cheng-tao1，2，ZHANG Chan1，2，*，LIU Lu-xiang3
（1.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing 100048，China；2.Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University（BTBU），Beijing 100048，China；3.Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Center of Space Mutagenesis for Crop Improvement，Beijing 100081，China）

Using of the Beijing electron-positron collider linear accelerator E2 beam shooting produce highenergy hybrid particle field processed two Monascus Purpureus strains M1 and M2 with the dose of 64.3 Gy，after initial and second screening，using HPLC method to detect the Monacolin K content in the mutant，and genetic stability experiments，thus breeding high Monacolin K and low yield citrinin mutant.The results showed that:after hybrid particle field irradiated，Monascus Purpureus M1 and M2 obtained 43 and 22 high yield Monacolin K mutants，respectively，the mutation rate was 74.64%and 56.72%，respectively，in which the positive mutation rate was 60.56%and 32.84%，respectively.Monacolin K content of M1-20 and M2-4 mutant reached 421.69 mg/L and 406.68 mg/L，which improved 142.14%and 101.27%than the original strain，respectively，Monacolin K content of M1-20 and M2-4 mutant decreased 4.21%and 1.65%after subculture for 5 times，respectively，and citrinin content of two mutant were between 0.01 mg/L and 0.04 mg/L，which compared with the original strain，citrinin content were significantly decreased.High-energy hybrid particle field could cause colony morphology and color change of Monascus Purpureus，high mutation rate，the mutant strains of genetic stable performance could be obtained，it was a kind of new method that could be applied in the microbial mutation breeding.

Monascus Purpureus；Monacolin K；hybrid particle field；strain screening

TS201.3

A

1002-0306（2016）02-0165-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.025

2015－06－10

郎天丹（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術，E-mail：langtiandan@163.com。

*通訊作者：張嬋（1984-），女，博士，副教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：zhangchan@th.btbu.edu.cn。

國家自然科學基金項目（31301411）；北京市教委（KM201410011009）；北京市科技計劃項目（Z151100001215008）。