陳化進程中大米淀粉與谷蛋白的相互作用

劉成梅，徐夢涵，鐘業俊，楊曉會（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047）

陳化進程中大米淀粉與谷蛋白的相互作用

劉成梅，徐夢涵，鐘業俊*，楊曉會
（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047）

為進一步闡明大米陳化機理，本研究以熒光和紫外光譜等為手段，探討加速陳化過程中大米淀粉-谷蛋白混合物的相互作用，及其對復合物溶解性、起泡性和消化性能的影響。結果顯示，陳化過程中谷蛋白溶解度和起泡性逐漸下降，且隨著大米淀粉的加入進一步降低。紫外及熒光分析表明，陳化過程中，淀粉的加入影響了陳化進程中谷蛋白的三級結構，色氨酸和酪氨酸殘基周圍微環境發生改變，蛋白質分子與淀粉相互締合，且隨著陳化的進行愈加緊密，造成熒光發射峰紅移并產生熒光猝滅，以及谷蛋白與淀粉消化性能的下降。隨著淀粉含量增加，谷蛋白的消化率降低速率增大，與此相應，谷蛋白比例增加也迫使淀粉消化率下降。

大米淀粉，谷蛋白，陳化，相互作用

陳化是稻米收割以后，隨著儲藏時間、溫度和水分而變化的一種非人為、自然發生的現象［1］。陳化過程中，稻米組織硬化，柔性與韌性變弱，淀粉細胞變硬，持水能力減退［2］。一般認為，大米陳化受內部成分影響較大。研究表明，陳化過程中淀粉微晶束得到加強，組織結構變得緊密，導致內部淀粉難以糊化［3］；此外，陳化過程中蛋白-SH含量減少，空間結構變得松散，造成米飯粘性下降［4］。

實際上，大米陳化機理仍未完全闡明，目前國際上主要從熱力學性質［3］、糊化特性［5］、晶體結構［1］和表面疏水性［6］等角度來探討大米陳化行為和結構的關系，如Hamaker等［7］通過破壞蛋白質的二硫鍵觀察大米的流變學特性，發現二硫鍵破壞后米飯的粘性提高；Hamaker等［8］報道陳化過程中大米蛋白總量基本不變，但在光、熱等作用下，蛋白質巰基逐漸氧化成二硫鍵；Likitwattanasade等［9］報道陳化過程中蛋白與淀粉的相互作用和二硫鍵的變化會影響大米糊化性質。

整體而言，目前關于大米陳化主要還是集中在理化性質變化的探討和分析上，關于陳化導致淀粉分子與蛋白結構相互作用變化的報道還很缺乏。由此，本文從分子結構及相互作用等角度，探討分子結構變化對復合物消化性能、溶解性及起泡性的影響，采用熒光光譜、紫外-可見光光譜等手段，研究陳化過程中淀粉和谷蛋白的相互作用，為進一步闡析大米陳化機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷蛋白、大米淀粉 均購于江西金農生物科技有限公司；α-淀粉酶（10080-25G，EC 3.2.1.1，50 U/mg）、胃蛋白酶（P7000-25G，EC 3.4.23.1，250 U/mg） 購于Sigma公司；胰蛋白酶（PTN 6.0S，EC 3.4.21.4，1350 U/mg） 購于諾維信（中國）生物技術有限公司；考馬斯亮藍G-250 國產分析純試劑。

F-7000型熒光分光光度計 日本HITACHI公司；UV-1600型紫外可見光分光光度計 上海美普達儀器有限公司；T18型高速均質分散機 德國IKA公司；Anke LXJ-HB型離心機 上海安亭科學儀器總廠；恒溫恒濕培養箱 上海鴻都電子科技有限公司；FD-1型冷凍干燥機 北京德天佑科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品陳化 淀粉是大米的主要成分，然而儲藏過程中，只有局部的淀粉能與谷蛋白發生相互作用。因此，本實驗稱取谷蛋白與大米淀粉，分別按質量比1∶0、1∶1和2∶1混合均勻，參照Likitwattanasade等［9］的方法進行改進，置于恒溫恒濕培養箱（48℃、濕度75%、三組樣品水分含量為9.3%±0.4%）加速陳化60 d，每15 d取一次樣進行檢測。

1.2.2 溶解度測定 考馬斯亮藍法測定［10］：以標準牛血清蛋白測定標準曲線，得到公式y=0.0095x+0.1494，R2=0.998。將樣品混合物配制成谷蛋白濃度為400 μg/mL的溶液，調節pH至12，取0.5 mL樣品溶液，加入0.5 mL蒸餾水，以1 mL蒸餾水作為空白，分別加入5 mL考馬斯亮藍溶液，混合均勻后2 min～1 h內于595 nm下測定樣品的A值，代入公式計算可得所溶解的谷蛋白含量。

谷蛋白溶解度（%）=（樣品中溶解的谷蛋白含量/溶液中谷蛋白含量）×100

1.2.3 起泡性測定 參照涂宗財等［11］方法，采用攪打法測定樣品的起泡性：50 mL樣品溶液在室溫下于高速均質分散機中攪打2 min，均質壓力在8000～12000 Pa，然后快速轉移至100 mL量筒中，記錄泡沫高度，即為起泡性。

1.2.4 紫外可見光光譜測定 采用UV-1600紫外可見光分光光度計，記錄230～360 nm波長范圍內的掃描光譜。

1.2.5 熒光光譜測定 采用F-7000熒光分光光度計，掃描速度：1500 nm/min，Delay：0 s，EX Slit：5.0 nm，EM Slit：5.0 nm。以280 nm為激發波長，記錄300～450 nm波長范圍內的發射光譜。

1.2.6 模擬體外消化性的測定 參照Pérez（2014）等

［12］的方法，樣品糊化后置于錐形瓶中，加入30 mL磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液（pH5.2），混勻后37℃預熱5 min，加入α-淀粉酶，37℃恒溫振蕩120 min后取樣。用DNS比色法測定還原糖含量［13］，計算還原糖釋放率。用鹽酸溶液調節pH至1.5后加入胃蛋白酶120 min后，加入胰蛋白酶再消化120 min取樣測定谷蛋白消化率。

1.3 統計分析

每實驗重復3次，采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理，結果以x±s表示。

2 結果與討論

2.1 陳化過程中大米淀粉對谷蛋白溶解性和起泡性的影響

在60 d的陳化過程中，谷蛋白樣品溶解度逐漸由37.2%降低到31.9%，下降了5.3%；當谷蛋白與淀粉質量比2∶1時，溶解度則由36.3%降低到28.3%，下降了8.0%；當谷蛋白與淀粉質量比1∶1時溶解度由35.6%降低到23.0%，下降幅度達到12.6%（如圖1）?？梢?，陳化過程中谷蛋白的溶解性逐漸降低，加入大米淀粉后，蛋白溶解性降幅增大，且淀粉比重越高，降幅越大。據報道，陳化過程中，極性的巰基轉化成二硫鍵降低了蛋白質分子與水分子的相互作用，導致大米谷蛋白的水合能力下降［14］。與此類似，高瑀瓏等［15］報道，儲藏后稻米中蛋白質的水溶性下降，這在本研究中得到證實。盧薇等［16］研究表明，大米谷蛋白的添加（0%～20%）會逐漸降低大米淀粉的持水能力，延遲其水化過程。

圖1 陳化過程中蛋白溶解性和起泡性的變化Fig.1 The changes of solubility and foaming property of glutelin during aging

此外，在60 d的陳化過程中，谷蛋白樣品起泡性逐漸由80.1 mL降低到68.6 mL，降低了11.5 mL；當谷蛋白與淀粉質量比2∶1時，起泡性則由78.8 mL降低到63.8 mL，下降了15.0 mL；當谷蛋白與淀粉質量比1∶1時起泡性由77.9 mL降低到57.6 mL，下降幅度達到20.3 mL（如圖2）。可見，陳化過程中谷蛋白的起泡性逐漸下降，而淀粉的加入進一步抑制了泡沫的形成，且增加淀粉比重，抑制效果更明顯。谷蛋白分子具有典型的兩親結構，在分散液中表現出較強的界面活性，具有一定程度的降低界面張力的作用，在劇烈攪拌時形成泡沫［11，17］。蛋白質的溶解性及起泡性與其擴散并吸附在空氣/水界面的能力有關，氫鍵、疏水作用和靜電相互作用等非共價鍵作用均會影響蛋白質的水合性質［14，18］。同時，陳化后大米蛋白質中巰基氧化交聯成二硫鍵，分子量增大，蛋白質堿提取率降低［8，19］。李彤等［20］將大米加速陳化數周后發現谷蛋白起泡性及起泡穩定性下降。

2.2 紫外光譜分析

蛋白質在紫外吸收光譜的280 nm附近有特征吸收峰［17］，這是由肽鏈上色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環π→π*躍遷引起的。在60 d的陳化過程中，樣品在280 nm附近的特征吸收峰均未發生位移；然而，谷蛋白在280 nm處的吸收值逐漸從0.5874降低至0.4399（降低0.1475）（圖2a）；當谷蛋白與淀粉質量比2∶1時，280 nm處紫外吸收值在陳化過程中降低速率加快，由0.5506逐漸降低至0.3905（降低0.1601）（圖2b）；而谷蛋白與淀粉質量比1∶1時，285 nm處紫外吸收值由0.5914逐漸降低至0.3936（降低0.1978）（圖2c）?？梢姡矸鄣募尤雽е碌鞍自?80 nm處的紫外吸收值下降，且隨淀粉比例升高，下降速率增大，表明淀粉的加入可能影響了陳化過程中谷蛋白的三級結構，使色氨酸和酪氨酸殘基周圍微環境發生變化［17］，推測是由于蛋白與淀粉分子可能相互締合造成的。據趙學偉等［21］報道，大米陳化過程中，大米蛋白質與淀粉相互作用增加，導致淀粉與蛋白質的結構及性質發生變化。

圖2 陳化過程中谷蛋白紫外光譜的變化Fig.2 The changes of UV spectrum of glutelin during aging

2.3 熒光光譜分析

圖3 陳化過程中谷蛋白熒光光譜的變化Fig.3 The changes of fluorescence spectroscopy of glutelin during aging

蛋白的內源熒光是由其內部色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）殘基激發產生的，它們對周圍環境（微環境）非常敏感，當微環境發生變化時，熒光光譜也發生相應變化［17］。在60 d的陳化過程中，谷蛋白的熒光峰值均出現在345.0 nm處，熒光強度則逐漸由248.4下降至151.8（圖3a）；當谷蛋白與淀粉質量比2∶1時，熒光強度由248.1下降至129.6，熒光峰值由344.4 nm紅移到348.6 nm（圖3b）；而當谷蛋白與淀粉質量比1∶1時，熒光強度由247.7下降至110.4，熒光峰值則由345.0 nm紅移到了350.4 nm（圖3c）?？梢?，在加入淀粉后，谷蛋白在陳化過程中不僅熒光強度降低，熒光峰值也發生紅移，且淀粉比例增加，熒光強度下降更多，紅移更為明顯。該結果表明，陳化過程中，蛋白質分子與淀粉相互締合，這種結合隨著陳化進行愈加緊密，導致熒光發射峰紅移并產生熒光猝滅［22］。實際上，淀粉和蛋白質的相互作用是影響稻米質構特性的關鍵，與稻米陳化密切相關［23］；通過相互作用，陳化后的淀粉與谷蛋白混合物主要以復合物形式存在，蛋白質以膜狀物形式包裹在淀粉顆粒的周圍［24］。

2.4 陳化過程中大米淀粉與谷蛋白消化性的變化

在60 d的陳化過程中，純谷蛋白的消化率降低了6.57%，當谷蛋白與淀粉質量比為2∶1時降低了12.48%，谷蛋白與淀粉質量比為1∶1時降低了24.20%（圖4a）?？梢?，陳化過程中谷蛋白的消化率逐漸降低，且隨著樣品中淀粉含量的增加，谷蛋白的消化率降低速率增大。此外，陳化過程中，谷蛋白比例增加也使淀粉的消化率明顯降低，至第60 d時，谷蛋白與淀粉質量比1∶1樣品的還原糖釋放率降低了23.60%，谷蛋白與淀粉質量比2∶1的樣品則降低了34.14%（圖4b）。這可能是陳化過程中，谷蛋白與淀粉逐漸相互結合，以及復合物中的空間位阻效應影響了復合物的消化性能（谷蛋白與淀粉在陳化過程中逐漸相互結合已通過紫外與熒光光譜分析得到證實）。實際上，蛋白能與淀粉形成網狀結構，降低淀粉的體外水解速率［25］；蛋白類物質也可包裹在淀粉周圍形成膜狀物質，增加慢消化性淀粉含量［23］。在大米儲藏過程中，蛋白質的低分子量肽減少，高分子量肽增加，肽亞基之間的結合力發生改變，進而影響谷蛋白的消化性［15］。此外，在陳化過程中，大米淀粉體系中慢消化性淀粉和抗性淀粉含量也顯著增加［26］。

圖4 陳化過程中谷蛋白（a）與淀粉（b）消化性的變化Fig.4 The changes of digestibility of glutelin（a）and starch（b）during aging

3 結論

本研究表明，陳化過程中，谷蛋白吸附在空氣/水界面的能力逐漸降低，導致溶解度和起泡性下降，且隨淀粉比例增加，降幅增大。結構分析顯示，陳化過程中，淀粉的加入使谷蛋白色氨酸和酪氨酸殘基周圍微環境發生了變化，熒光發射峰紅移并產生熒光猝滅。此外，陳化過程影響了谷蛋白與淀粉的消化性能。隨著復合物中淀粉含量的增加，谷蛋白的消化率降低速率增大，與此對應，谷蛋白比例增加也使淀粉的消化率明顯降低，這可能是陳化過程中谷蛋白和淀粉相互滲透、逐步締合導致的。本研究探討了陳化過程中淀粉和谷蛋白的相互作用，可為進一步闡析大米陳化機理提供依據。

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Interaction between rice starch and glutelin during aging

LIU Cheng-mei，XU Meng-han，ZHONG Ye-jun*，YANG Xiao-hui
（The National Key Laboratory of Food Science，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Fluorescence spectroscopy and UV spectrum were used in this study to elucidate the mechanism of rice aging.Investigated.interactions between rice starch and glutelin，and the impacts of their interaction on solubility，foaming property and digestibility.The results showed that solubility and foaming property of glutelin were gradually reduced during aging，and the reduced rate was growing with the addition of starch.UV spectrum and Fluorescence spectroscopy analysis showed that the addition of starch affected the tertiary structure of glutelin during aging，and microenvironment around tryptophan and tyrosine residues were changed.Glutelin and starch was associated tightly during aging which further caused red-shift of fluorescence emission peaks and fluorescence quenching.Besides，the digestibility of glutelin and starch were also decreased.With increasing of the content of starch，the reduced rate of digestibility of glutelin was increased，correspondingly，the increased proportion of glutelin also caused the drop of starch digestibility.

rice starch；glutelin；aging；interaction

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0156-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.023

2015－06－15

劉成梅（1963-），男，博士，教授，主要從事食品資源利用及開發方面的研究，E-mail：liuchengmei@aliyun.com。

*通訊作者：鐘業?。?982-），男，博士，副教授，主要從事農產品資源的開發與利用方面的研究，E-mail：zhongyejun@126.com。

“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD37B02-02）與農業部熱帶作物產品加工重點實驗室開放基金（KLTCPP-201404）共同資助。