3種二苯乙烯類化合物的穩定性研究

喻 艷，向 偉，劉俊池，徐 立（西南大學生物技術學院，重慶400715）

3種二苯乙烯類化合物的穩定性研究

喻 艷，向 偉，劉俊池，徐 立*
（西南大學生物技術學院，重慶400715）

采用超高效液相色譜儀（UPLC）測定白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇和桑皮苷A含量的變化，分別研究了溫度、光照和酸堿度對3種化合物穩定性的影響。結果表明3種化合物在不同溫度下，其有效期不同，白藜蘆醇在4℃下可保存74.67年，氧化白藜蘆醇在-40℃下有效期可達11.44年，而桑皮苷A在-40℃下的有效期可達3.65年。光照對3種化合物穩定性的影響效應依次為：桑皮苷A＞氧化白藜蘆醇＞白藜蘆醇；白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇和桑皮苷A的最適pH分別為3.24、5.38和4.3。這些結果為3種化合物的提取、分離、儲存、運輸與開發利用提供了有效參考。

白藜蘆醇，氧化白藜蘆醇，桑皮苷A，穩定性，超高效液相色譜

在傳統醫學上，桑樹的各個部位都可以入藥，近年來國內外相關學者對桑屬植物各個部位的化學成分、生物活性、藥理作用、臨床應用等方面都做了較為系統的研究［1-4］，發現了一系列重要的生物活性成分，白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇和桑皮苷A就是從桑樹皮中發現的一類具有多種生物活性的二苯乙烯類化合物，并受到了各領域越來越多研究人員的關注。白藜蘆醇活性顯著，對心血管具有雙向調節作用，能改善微循環，具有顯著的抗炎、抗氧化、降血糖、保護肝臟以及抗癌等多方面的活性［5］；氧化白藜蘆醇是一種高效的酪氨酸酶抑制劑［6］，具有皮膚色素沉淀、抗炎［7］、抗氧化［8-9］、降血糖及果蔬防腐抗菌［10］等活性；桑皮苷A是植物的抗菌素，是植物受到病菌感染、紫外線照射或者化學污染等刺激時產生的物質，能治療酒精肝、抗炎、鎮痛、止咳等［11］。有效地保持這3種天然活性物質在提取、分離純化、儲存等研究及生產過程中的穩定性是非常必要的，但只有對白藜蘆醇在有機溶劑溶解性、紫外光和可見光照射的穩定性方面有研究［12-13］，其余兩種物質的穩定性研究鮮見報道。

化合物所處的溶劑環境、溫度、光線、pH以及環境中的一些物質如添加物［14］、金屬離子［15］、氧化劑［16］、還原劑［17］都會影響化合物的穩定性［18］。但在研究、生產、儲存的過程中，影響天然活性物質穩定性的因素最主要包括溫度、酸堿度及光照。基于此，本實驗研究了溫度、光照及酸堿度對白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇、桑皮苷A穩定性的影響，以期為3種物質的提取、分離、貯存、生產等研究以及桑樹的開發提供實用信息。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白藜蘆醇標準品 純度≥98%，上海生工生物工程技術服務有限公司；氧化白藜蘆醇標準品（純度≥98%）、桑皮苷A標準品（純度≥98%） 成都曼思特生物有限公司；磷酸二氫鈉 分析純，成都市科龍化工試劑廠；檸檬酸 分析純，重慶川東化工有限公司；甲醇 色譜級，美國Sigma公司。

ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜 美國waters公司；FA2104電子天平 上海精天電子儀器有限公司；數控超聲波清洗器 頻率40 kHz，最大輸出功率700 W，昆山市超聲儀器有限公司；Direct-QTM純水儀 法國Millipore公司；HH-2恒溫水浴鍋 國華電氣有限公司；RXZ-300C智能人工氣候箱 寧波東南儀器有限公司；TES 1332A數字照度計 臺灣泰仕TES公司；pHS-3C+酸度計 方舟科技。

1.2 實驗方法

1.2.1 溫度對3種二苯乙烯類化合物的處理 精確配制10 μg/mL的白藜蘆醇標準品溶液，分裝到若干個25 mL的棕色容量瓶中并定容。將其置于溫度分別為60℃（分別設置0、2、4、6、8、10 h 6個處理時間）、70℃（分別設置0、1.5、3、4.5、6、7.5 h 6個處理時間）、80℃（分別設置0、1、2、3、4、5 h 6個處理時間）、90℃（分別設置0、0.5、1、1.5、2、2.5 h 6個處理時間）的恒溫水浴鍋中熱處理，熱處理結束后快速取出置于冷水中，迅速降至室溫，定容，過0.22 μm微孔濾膜，用UPLC測定其含量，每個處理設置3個重復。氧化白藜蘆醇和桑皮苷A的處理同白藜蘆醇。

1.2.2 光照對3種二苯乙烯類化合物的處理 精確配制10 μg/mL的白藜蘆醇標準品溶液，以8 mL為單位分別裝到若干個棕色樣品瓶和若干個白色樣品瓶中。然后將樣品瓶放入光照強度為（5500±200）lux的恒溫培養箱中日光燈進行光照，分別處理0、2、4、6、8、10、12、14、16、24 h后，過0.22 μm微孔濾膜，用超高效液相色譜測定其含量，每個處理設置3個重復。氧化白藜蘆醇、桑皮苷A的操作方法同上。

1.2.3 pH對3種二苯乙烯類化合物的處理 配制不同pH2、3、4、5、6、7、8的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液，用酸度計實際測得緩沖液的pH分別為2.4、3.24、4.3、5.38、6.26、7.12、8.11。用檸檬酸緩沖液精確配制50 μg/mL白藜蘆醇溶液，分別取2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，于室溫、黑暗環境放置4 h后，過0.22 μm微孔濾膜，然后用UPLC測定其含量，每個處理設置3個重復。氧化白藜蘆醇和桑皮苷A的操作方法同上。

1.2.4 3種二苯乙烯類化合物含量的UPLC測定 精確配制50 μg/mL的白藜蘆醇標準品溶液150 mL，作為母液待用。從母液中取25 mL以對半稀釋法配制成濃度為50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的白藜蘆醇梯度溶液。過0.22 μm微孔濾膜，用UPLC測定，每組設置3個重復，以濃度為橫坐標X，以三種化合物的含量為縱坐標Y繪制標準曲線。氧化白藜蘆醇和桑皮苷A的操作方法同上。

預實驗得到UPLC的檢測條件。白藜蘆醇的UPLC檢測條件為：1.7 μm C18（2.10 mm×50 mm）ACQUITY UPLC?BEH色譜柱，流動相：甲醇∶水=50∶50（v/v），流速0.35 mL/min，檢測波長306 nm，進樣量0.7 μL，柱溫30℃。氧化白藜蘆醇和桑皮苷的UPLC檢測條件為：1.7 μm C18（2.10 mm×50 mm）ACQUITY UPLC?BEH色譜柱，流動相：甲醇∶水=45∶55（v/v），流速0.35 mL/min，檢測波長306 nm，進樣量0.7 μL，柱溫30℃。

1.2.5 數據分析 數據用Origin 7.5作圖，SPSS 17.0分析。

2 結果與分析

2.1 3種化合物的UPLC分析及其標準曲線

圖1 3個化合物的UPLC色譜圖Fig.1 The UPLC chromatogram of three compounds compounds

白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇和桑皮苷A的標準曲線的線性回歸方程分別為Y=9.23e+003X+3.03e+003 （R2=0.990978）、Y=6.60e+003X+3.65e+003（R2= 0.99249）和Y=3.95e+003X-3.81e+001（R2=0.999954），其線性范圍均為3.125～50 μg/mL。如圖1所示，三者的保留時間分別為0.57、0.54、0.37 min，色譜吸收峰都較明顯，說明它們的檢測條件可行。

2.2 溫度對3種化合物穩定性的影響

根據Arrhenius定律［18］：

其中K是反應速度常數；A是頻率因子；E為活化能；R為氣體常數；T是絕對溫度。以lgK對1/T作圖得一直線，直線斜率=-E/（2.303R），由此可計算出活化能E。將直線外推至室溫，就可以得出室溫時的速度常數K25℃，由K25℃可求出分解10%所需的時間t0.9。在藥物降解反應中常將藥物在室溫下降解10%所需的時間（t0.9）作為有效期。

表1 溫度對3種化合物的影響Table1 Effect of temperature on three compounds

據Arrhenius定律以lgK對1/T作線性回歸（見表1），得直線方程白藜蘆醇：lgK=-4869.2/T+12.453；氧化白藜蘆醇：lgK=-3310/T+8.2278；桑皮苷A：lgK=-2618.2/ T+5.755；將室溫25℃（T=298 K）代入直線方程，得室溫反應速度常數K25℃白藜蘆醇=1.2984×10-4/h，代入公式t0.9=0.1054/K25℃=33.8 d；K25℃氧化白藜蘆醇=1.3195×10-3/h，代入公式t0.9=0.1054/K25℃=3.33 d；K25℃桑皮苷A=9.311×10-4/h，代入公式t0.9=0.1054/K25℃=4.7 d。即在25℃下白藜蘆醇的有效期為33.8 d，氧化白藜蘆醇有效期為3.33 d，桑皮苷A有效期為4.7 d。

同樣的，理論上放置于4℃冰箱保存，白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇、桑皮苷A有效期分別為1.61年、23.13 d、21.8 d。置于-20℃環境中存放，白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇、桑皮苷A有效期分別為74.67年、314.6 d、172.8 d。存放于-40℃冰箱中，氧化白藜蘆醇、桑皮苷A有效期分別為11.44年、3.65年，白藜蘆醇有效期則更長，達數百年。

結果表明，白藜蘆醇在4℃條件下保存穩定性較好，-20℃條件下穩定性非常好。氧化白藜蘆醇在室溫下非常不穩定，貯存在-40℃條件下，有效期可達到11.44年，穩定性非常好。桑皮苷A在室溫、4℃條件下均非常不穩定，在-40℃條件下貯存有效期可達3.65年，低溫貯存大大提高了桑皮苷A的穩定性。

2.3 光照對3種化合物穩定性的影響

3 種化合物經過（5500±200）lux的強光照射后，其各個處理的含量如圖2所示。

圖2 光照對3種化合物穩定性的影響Fig.2 Effect of light on stability of three compounds

由圖2可知，隨著光照時間延長，白色瓶和棕色瓶中3種化合物的含量均出現了降低的趨勢，且同種化合物的棕色瓶中含量的變化明顯比白色瓶中含量的變化平緩，說明棕色瓶對3種二苯乙烯類化合物有保護作用，可提高其穩定性。光照初期，白色瓶中的白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇、桑皮苷A分別處理12 min后，其含量分別下降了28.28%、59.13%、77.73%，說明桑皮苷A和氧化白藜蘆醇光敏感性很高，白藜蘆醇相對較低。隨著光照時間的延長，化合物濃度降低到一定程度后，便趨于平穩。3種化合物在棕色瓶和白色瓶中處理24 h后的含量差分別為：3.815、0.863、4.215 μg/mL。光照對3種二苯乙烯類化合物的穩定性影響從大到小的排列順序為：桑皮苷A＞氧化白藜蘆醇＞白藜蘆醇。因此，3種化合物見光均易降解，不穩定，應于黑暗處保存和處理。

2.4 pH對3種化合物穩定性的影響

圖3 pH對3種化合物穩定性的影響Fig.3 Effect of pH value on stability of three compounds

用酸度計測定所配制的緩沖溶液的pH，測定結果為：2.4、3.24、4.3、5.38、6.26、7.12、8.11。發現實際測定結果值比理論值偏高，這可能是檸檬酸因放置后受潮，所配溶液中的檸檬酸濃度偏低所致。

如圖3所示，白藜蘆醇在pH3.24左右最穩定。pH在2.4～6.26間，白藜蘆醇的含量變化不大，說明白藜蘆醇在此pH范圍較為穩定；而pH在7.12時，白藜蘆醇的含量降為0 μg/mL，說明白藜蘆醇在中性和堿性環境中極不穩定。氧化白藜蘆醇的最適pH約為5.38。在pH2.4～6.26范圍內，相對其它兩種化合物氧化白藜蘆醇的含量變化較為明顯，再所配制的標準濃度的基礎上減少了45%左右。桑皮苷A的最適pH約為4.3。pH為2.4時，桑皮苷A的含量相對于標準品濃度減少了30%左右，而pH在3.24～7.12范圍內，桑皮苷A含量相對于pH2.4時略有增加，可能是由于實驗過程中溶劑揮發，導致溶質物質的量增加而出現的桑皮苷A含量增加。在pH為8.11時，未檢測到桑皮苷A的含量。3種化合物在中性和堿性條件下都不穩定，主要原因是其含有多個酚羥基，有較強的失電子能力，性質比較活潑，易被氧化成醌類物質［19］。當然酸或堿可使溶液中不同的反應速度增大，即發生了催化作用，無論酸或堿催化反應中，都是以質子轉移來完成反應，這是酸堿催化的一個特征［18］。

UPLC測定的化合物濃度大于所配制的濃度，推測其原因可能是實驗過程中誤差造成的。實驗中3種物質均為二苯乙烯類化合物，結構相似，具有多個酚羥基，電子云密度比較高，在酸性條件下，不易得電子，性質較穩定。但在堿性條件下，由于具有較強的失電子能力，性質比較活潑，易被氧化成醌類物質，所以3種物質均不宜保存在堿性環境中。

3 結論

溫度、光照及酸堿度這些環境因素是影響活性物質穩定性的主要因素，分別研究了溫度、自然光和酸堿對白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇和桑皮苷A穩定性的影響。結果表明，白藜蘆醇在-20℃條件下可保存74.67年，氧化白藜蘆醇和桑皮苷A在-40℃條件下分別可保存11.44年和3.65年。三者見光易分解，儲存過程中，棕色試劑瓶可適當降低其轉化和分解。儲存過程中，白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇和桑皮苷A最佳保存pH分別在3.24、5.38和4.3左右。實驗結果為天然白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇和桑皮苷A的生產和儲存工藝提供了可用的數據參考。

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Stability analysis of three kinds of stilbene compounds in Morusalba L.

YU Yan，XIANG Wei，LIU Jun-chi，XU Li*
（College of Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400715，China）

The factors including temperature，light，acid and alkali were used to study the stability of the three compounds.The contents of the three compounds were measured with ultra performance liquid chromatography （UPLC）.The results showed that three kinds of compounds had different period of validity in different temperatures，the resveratrol could be preserved for 74.67 years in 4℃，oxyresveratrol and mulberroside A were valid up to 11.44 years and 3.65 years in-40℃ respectively.The effect of light on the stability of mulberroside A was strongest，followed byoxyresveratrol，with weakest effect for resveratrol.The optimum pH of resveratrol，oxyresveratrol and mulberroside A were 3.24，5.38 and 4.3 respectively.These results provided effective reference for the extraction，separation，storage，transportation，utilization of the three compounds.

resveratrol；oxyresveratrol；mulberroside A；stability；ultra performance liquid chromatography

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0148-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.021

2015－05－06

喻艷（1990-），女，碩士研究生，主要從事植物化學方面的研究，E-mail：yuyan19900914@163.com。

*通訊作者：徐立（1976-），男，博士，副教授，主要從事植物化學方面的研究，E-mail：mulberry@swu.edu.cn。

中央高校基本科研業務費專項基金項目（XDJK2015C131）；重慶市研究生科研創新項目（CYS2015069）。