花生紅衣乙醇提取物乙酸乙酯組分抑菌活性的研究

趙 萍，竹 軍，劉 冰，2，王克輝，劉 輝，張 政，伍宏澤，杜梟雄（.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009）

花生紅衣乙醇提取物乙酸乙酯組分抑菌活性的研究

趙 萍1，竹 軍1，劉 冰1，2，王克輝1，劉 輝1，張 政1，伍宏澤1，杜梟雄1
（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009）

花生紅衣乙醇提取物乙酸乙酯部位加入AB-8大孔樹(shù)脂層析柱中，用20%、40%、60%、80%、100%乙醇水溶液依次洗脫，得到花生紅衣乙醇提取物乙酸乙酯組分，采用濾紙片法研究其抑菌活性，確定最小抑菌濃度。結(jié)果表明：花生紅衣乙醇提取物乙酸乙酯組分對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、青霉、毛霉和黑曲霉的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，最低抑菌濃度均為0.5 g/L，且抑菌圈大小隨濃度的增加而變大?；ㄉt衣乙醇提取物乙酸乙酯組分均具有廣譜抑菌活性。

花生紅衣乙醇提取物乙酸乙酯部位，洗脫組分，抑菌活性

花生在我國(guó)的產(chǎn)量居于世界第一，是主要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物［1］?；ㄉt衣，即花生種皮，占粒重的1%～3%，其中的碳水化合物含量高達(dá)40%以上，含有大量粗纖維和蛋白質(zhì)，還含有原花青素、白藜蘆醇、維生素K等生物活性物質(zhì)［2］?；ㄉt衣是花生加工業(yè)的副產(chǎn)物，其研究和利用依然不夠充分。在我國(guó)，花生紅衣主要用來(lái)做飼料的輔助添加物，用量及使用范圍極為有限，還未涉及到深加工的領(lǐng)域［3］。對(duì)花生紅衣的生物活性的研究主要集中在抗氧化活性方面［4-7］，也有對(duì)其抗腫瘤活性［8］、抑菌活性［9］、抗敏反應(yīng)［10］、降膽固醇［11］、降血脂［12］等方面的研究。

目前，常用的抑菌劑是一些抗生素，濫用抗生素會(huì)使藥物療效降低，疾病更難治，從天然植物中提取抑菌防腐活性物質(zhì)具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)供試菌為大腸桿菌（G－）、金黃色葡萄球菌（G+）、枯草芽孢桿菌（G+）、青霉、毛霉、黑曲霉，是食品中常見(jiàn)的污染菌。本實(shí)驗(yàn)對(duì)花生紅衣乙醇提取物乙酸乙酯組分（EEPT，the ethyl acetate fraction of ethanol extract of peanut testa）的抑菌活性進(jìn)行研究，從加工副產(chǎn)物綜合利用和抑菌防腐物質(zhì)的篩選兩個(gè)方面均有意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魯花大花生花生紅衣 山東魯花集團(tuán)有限公司提供；供試菌株為大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium sp.）、毛霉（Actinomucor sp.）和黑曲霉（Aspegillus niger） 由蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供；乙醇、乙酸乙酯、石油醚 均為分析純。

6 E220型粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器廠；HX202T型分析天平 慈溪市天東衡器廠；RE5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 北京國(guó)華電器有限公司；AB104-N型電子分析天平 梅特勒－托利多儀器有限公司；JJ-CJ-ID型潔凈工作臺(tái) 吳江市凈化設(shè)備總廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EEPT各組分的制備 將5 kg花生紅衣粉碎，過(guò)40目篩，用雙層紗布包裹，置于裝有80%乙醇的滲漉桶中進(jìn)行提取［13］。料液比為1∶5，提取時(shí)間24 h。靜置后棄去沉淀，上清液減壓濃縮。濃縮后的樣品轉(zhuǎn)至5 L的分液漏斗中，加入2 L石油醚，充分振蕩，靜置過(guò)夜。反復(fù)進(jìn)行萃取，直至上相無(wú)色，合并上相。石油醚萃取后的下相中加入2 L乙酸乙酯，充分振蕩，靜置過(guò)夜，重復(fù)萃取多次，直至上相無(wú)色，合并萃取液，即為乙酸乙酯有機(jī)相。

乙酸乙酯有機(jī)相加入AB-8大孔樹(shù)脂層析柱中（BV=1250 mL），經(jīng)20%、40%、60%、80%、100%的乙醇水溶液洗脫（20 mL/min，各個(gè)梯度洗脫2.5 BV），各洗脫組分45℃真空蒸發(fā)，得到乙酸乙酯有機(jī)相20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、100%乙醇洗脫組分，分別記為E20、E40、E60、E80、E100。

1.2.2 抑菌活性的測(cè)定 采用濾紙片法，通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑（mm），來(lái)評(píng)價(jià)各洗脫組分的抑菌活性［14-16］。將蒸干得到的各洗脫組分樣品用80%的乙醇水溶液溶解并配制成5個(gè)濃度梯度10、5、2.5、1、0.5 g/L的樣液。

將濾紙圓片（10 mm）滅菌后浸泡入不同濃度的樣品中，15 min后取出，用無(wú)菌鑷子放置到涂布好菌液的培養(yǎng)基上（各菌液含菌量106CFU/mL，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌菌液涂布于牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基上，黑曲霉、毛霉、青霉菌液涂布于PDA培養(yǎng)基上）。對(duì)照為0.85%無(wú)菌生理鹽水。3次平行，細(xì)菌37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，霉菌28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。觀察測(cè)量抑菌圈直徑，記錄結(jié)果。

表1 EEPT提取物不同組分的抑菌活性（mm）Table1 The antimicrobial activity of elution fraction of EEPT（mm）

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 采用濾紙片法，以不出現(xiàn)抑菌圈的最低樣品溶液濃度為該樣液的MIC。洗脫組分樣品用80%的乙醇水溶液溶解并配制成0、0.1、0.25、0.5、1 g/L 5個(gè)濃度梯度的溶液，對(duì)供試菌株做MIC實(shí)驗(yàn)。0.85%的無(wú)菌生理鹽水為對(duì)照。3次平行，培養(yǎng)同1.2.2，觀察各種菌有無(wú)生長(zhǎng)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 SPSS 13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有顯著的抑制作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌作用

生理鹽水對(duì)照組未觀測(cè)到明顯的抑菌圈。由表1分析可知，E20、E40、E60、E80、E100對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、青霉、毛霉、黑曲霉均有抑制作用。當(dāng)濃度達(dá)到0.5 g/L及以上時(shí)，培養(yǎng)基上可以觀察到明顯的抑菌圈。相同洗脫組分對(duì)同一種菌的抑制作用隨樣品溶液濃度的不斷升高，抑菌圈直徑逐漸增大，抑菌能力也隨之增強(qiáng)，但是均沒(méi)有顯著性差異，而相同洗脫組分同一濃度對(duì)不同種菌的抑制作用呈現(xiàn)不同的差異性。

2.1.1 E20的抑菌活性 0.5、5 g/L E20對(duì)毛霉的抑制作用最強(qiáng)，1、2.5、10 g/L E20對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)；5個(gè)濃度的E20對(duì)青霉的抑制作用均為最弱。

2.1.2 E40的抑菌活性 0.5、2.5、10 g/L E40對(duì)黑曲霉的抑制作用最強(qiáng)，5 g/L E40對(duì)毛霉的抑制作用最強(qiáng)；0.5 g/L E40對(duì)金黃色葡萄球菌有顯著的抑制作用，五個(gè)濃度的E40對(duì)大腸桿菌均沒(méi)有顯著的抑制作用。

2.1.3 E60的抑菌活性 0.5、1g/L E60對(duì)毛霉的抑制作用最強(qiáng)，2.5 g/L E60對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)，5、10 g/L E60對(duì)黑曲霉的抑制作用最強(qiáng)；0.5 g/L E60對(duì)青霉沒(méi)有顯著的抑制作用，1、2.5、5、10 g/L E60對(duì)大腸桿菌的抑制作用均為最弱。

2.1.4 E80的抑菌活性 0.5、1、5、10 g/L E80對(duì)毛霉的抑制作用最強(qiáng)，且0.5、5 g/L E80對(duì)毛霉的抑制作用具有顯著性，2.5 g/L E80對(duì)枯草芽孢桿菌有顯著的抑制作用；0.5 g/L E80對(duì)青霉的抑制作用最弱，1、2.5、5 g/L E80對(duì)大腸桿菌的抑制作用最弱，10 g/L E80對(duì)大腸桿菌和青霉均沒(méi)有顯著的抑制作用。

2.1.5 E100的抑菌活性 0.5、1、2.5、5 g/L E100對(duì)黑曲霉的抑制作用最強(qiáng)，且1 g/L E100對(duì)黑曲霉的抑制作用具有顯著性，10 g/L E100對(duì)毛霉的抑制作用最強(qiáng)；5個(gè)濃度的E100對(duì)大腸桿菌的抑制作用均為最弱，且1、2.5 g/L E100對(duì)大腸桿菌沒(méi)有顯著性的抑制作用，2.5 g/L E100對(duì)青霉沒(méi)有顯著的抑制作用。

2.2 最小抑菌濃度（MIC）

生理鹽水對(duì)照組未觀測(cè)到明顯的抑菌圈。由表2可知，E20、E40、E60、E80、E100對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、青霉、毛霉、黑曲霉的MIC均為0.5 g/L。

3 結(jié)論

E20、E40、E60、E80、E100 5個(gè)洗脫組分對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、青霉、毛霉、黑曲霉均有抑制作用。5個(gè)洗脫組分均對(duì)毛霉有很強(qiáng)的抑制作用，E20、E60、E80組分對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)，E40、E60、E100組分對(duì)黑曲霉的抑制作用最強(qiáng)；E20組分對(duì)青霉的抑制作用最弱，E40對(duì)大腸桿菌的抑制作用最弱，E60、E80、E100組分對(duì)大腸桿菌和青霉抑制作用均很弱。5個(gè)洗脫組分對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、青霉、毛霉、黑曲霉的最低抑菌濃度均為0.5 g/L，且抑菌圈大小隨濃度的增加而變大。花生紅衣乙酸乙酯組分具有廣譜抑菌活性。

表2 EEPT提取物不同組分的最小抑菌濃度Table2 The minimal inhibitory concentration of elution fraction of EEPT

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Antimicrobial activity of ethyl acetate fractions of ethanol extract of peanut testa

ZHAO Ping1，ZHU Jun1，LIU Bing1，2，WANG Ke-hui1，LIU Hui1，ZHANG Zheng1，WU Hong-ze1，DU Xiao-xiong1
（1.School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China；2.School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

The ethyl acetate fraction of ethanol extract of peanut testa joined into the AB-8 macroporous resin column chromatography and eluted by 20%，40%，60%，80%and 100%of ethanol solutions.The bacteriostatic activities and the minimum inhibitory concentrations of EEPT were invested by method of filter paper.The results showed that the different fractions of EEPT could inhibit the growth of Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，Penicillium sp.，Actinomucor sp.and Aspegillus niger.All of the minimum inhibitory concentration of them was 0.5 g/L，and the inhibition zone size became large with the concentration increasing.The different fractions of ethyl acetate fraction of ethanol extract of peanut testa were of broad spectrum bactericidal activity.

ethyl acetate fraction of ethanol extract of peanut testa；elution fraction；bacteriostatic activity

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0134-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.018

2015－04－07

趙萍（1964-），女，碩士，教授，主要從事食品科學(xué)、農(nóng)產(chǎn)品加工與副產(chǎn)物綜合利用方面的研究，E-mail：pingzhaogdqg@163.com。