聚集條件對(duì)羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)的影響

閆鳴艷，秦 松（中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，山東煙臺(tái)264003）

聚集條件對(duì)羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)的影響

閆鳴艷，秦 松*
（中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，山東煙臺(tái)264003）

采用Boltzmann函數(shù)擬合結(jié)合兩階段動(dòng)力學(xué)模型（成核階段和生長(zhǎng)階段），研究了膠原濃度、溫度、溶液pH和離子強(qiáng)度對(duì)羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)的影響。結(jié)果表明：膠原濃度、溫度、溶液pH和離子強(qiáng)度能調(diào)控膠原自聚集動(dòng)力學(xué)。當(dāng)濃度達(dá)到或高于0.34 mg/mL時(shí)，膠原表現(xiàn)明顯的自聚集，且濃度越高越有利于膠原晶核的形成，過(guò)量的膠原分子能阻礙膠原纖維的生長(zhǎng)；聚集溫度越接近膠原來(lái)源原料的生活溫度或溶液pH偏堿性，膠原越易自聚集；NaCl濃度也可影響膠原的自聚集動(dòng)力學(xué)，適量濃度的NaCl有利于膠原晶核的形成，但NaCl濃度過(guò)高卻對(duì)膠原纖維的生長(zhǎng)有阻礙作用。

膠原，自聚集，羅非魚(yú)，魚(yú)皮，動(dòng)力學(xué)

Ⅰ型膠原是動(dòng)物皮膚、軟骨、肌腱與韌帶等組織的基本結(jié)構(gòu)物質(zhì)［1］，由于其低抗原性、細(xì)胞粘附性、生物相容性和可降解性而被廣泛應(yīng)用于生物材料和組織工程等領(lǐng)域。膠原通常從豬和牛中提取，然而近年來(lái)由于瘋牛病、口蹄疫等頻發(fā)與宗教文化上的差異，豬牛源膠原的應(yīng)用受到限制。魚(yú)源膠原由于其來(lái)源的廣泛性、生物安全性和產(chǎn)品成本等方面均具有明顯優(yōu)勢(shì)［2］，因而對(duì)其研究和應(yīng)用逐漸受到重視。羅非魚(yú)是我國(guó)常見(jiàn)的淡水魚(yú)之一，其出口量的逐年增長(zhǎng)產(chǎn)生大量魚(yú)皮、魚(yú)骨等廢棄物，其中魚(yú)皮約占4.0%，而魚(yú)皮中的干物質(zhì)70%以上為膠原。因此，對(duì)羅非魚(yú)皮膠原進(jìn)行研究利用，不僅可減少環(huán)境污染與資源浪費(fèi)，更有利于提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

Ⅰ型膠原在體外能自聚集形成纖維，即具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原分子單體通過(guò)分子間的有序排列，形成具有交錯(cuò)條紋結(jié)構(gòu)（D-周期）的膠原纖維［2］，這是其在組織工程和生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用基礎(chǔ)。膠原的自聚性與溶液pH、離子強(qiáng)度、溶劑、溫度和濃度等密切相關(guān)［3-6］。到目前為止，相關(guān)學(xué)者已對(duì)狹鱈魚(yú)皮［7］、大馬哈魚(yú)［8］、草魚(yú)皮［2］和魚(yú)鱗［9］與烏鱧魚(yú)皮［10］等水產(chǎn)膠原在不同聚集條件下的自聚性開(kāi)展了研究，發(fā)現(xiàn)聚集條件對(duì)水產(chǎn)膠原的自聚集動(dòng)力學(xué)曲線有顯著影響。Fessler［11］認(rèn)為膠原的氨基酸組成隨物種和組織的不同而表現(xiàn)差異，因此研究不同來(lái)源膠原的自聚性是極其必要的。然而，目前的研究工作大多集中于膠原自聚集體形態(tài)方面，對(duì)膠原自聚動(dòng)力學(xué)的研究和解析甚少。因此，本文主要通過(guò)Boltamann函數(shù)擬合結(jié)合兩階段動(dòng)力學(xué)模型探討濃度、溫度、溶液pH和離子強(qiáng)度等對(duì)羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚動(dòng)力學(xué)的影響，研究結(jié)果將對(duì)天然海洋膠原基材料的研究開(kāi)發(fā)具有理論價(jià)值與參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚(yú)皮 由青島廠家提供，-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)4℃解凍；胃蛋白酶（1∶10000） 購(gòu)自Sigma公司。

BR4i冷凍離心機(jī) 法國(guó)Jouan公司；LGJ0-5冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科技儀器廠；UV-2102 PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海龍尼柯儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司；HHSNi電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原的制備 參照Huang Y等［12］的I型膠原制備方法進(jìn)行。由SDS-PAGE電泳分析其為Ⅰ型膠原。

1.2.2 膠原聚集條件 參照Yan M等的方法［7］。以濃度為0.5 mol/L的醋酸溶液為溶劑配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL的膠原溶液，將該溶液與等體積的40 mmol/L磷酸緩沖液（含有NaCl，pH為7.4）在冰浴中混合，使NaCl終濃度為0～260 mmol/L，膠原質(zhì)量濃度為0.23～2.12 mg/mL，混合均勻后調(diào)節(jié)溶液pH為5.4～9.4，立即將溶液分別放在20、30、37℃水浴中進(jìn)行自聚集。

1.2.3 膠原的自聚集動(dòng)力學(xué) 溶液中膠原的自聚集過(guò)程可通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法來(lái)表征［13］。每1 h測(cè)定一次溶液在400 nm下的吸光度值以表征溶液中膠原的聚集，以0 h時(shí)的膠原溶液為空白。

所得膠原自聚集動(dòng)力學(xué)曲線應(yīng)用Boltzmann函數(shù)進(jìn)行擬合，見(jiàn)式（1）。

依據(jù)Yan M等［7］的方法，膠原自聚集動(dòng)力學(xué)可通過(guò)式（2）進(jìn)行分析。

其中，At：膠原溶液在時(shí)間t時(shí)400 nm的吸光度；Ae：膠原溶液在平衡階段400 nm的吸光度；A0：膠原溶液在時(shí)間為0 h時(shí)400 nm的吸光度；k：速率常數(shù)。

將ln［（Ae-At）/（Ae-A0）］對(duì)時(shí)間t作圖可得到一條直線，斜率即為膠原自聚集速率常數(shù)k。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Origin 7.5進(jìn)行ANOVA單因素方差分析。p＜0.05，表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃度對(duì)羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)的影響

研究表明膠原的自聚集動(dòng)力學(xué)曲線為S型［7，13］，因此本研究通過(guò)Boltzmann函數(shù)對(duì)不同濃度膠原自聚集動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果如圖1（a）和表1所示。可以看出濃度為0.34、0.52、0.94、2.12 mg/mL的膠原自聚集動(dòng)力學(xué)曲線均可用Boltamann函數(shù)擬合（R2＞0.9），但濃度為0.23 mg/mL膠原的擬合結(jié)果較差（R2＜0.9），表明膠原在濃度為0.34～2.12 mg/mL時(shí)可發(fā)生明顯的自聚集，但膠原濃度為0.23 mg/mL的自聚集現(xiàn)象不明顯。Kadler［14］認(rèn)為膠原自聚集存在臨界濃度，在臨界濃度以上，膠原能自聚集形成明顯的聚集體；但在臨界濃度以下，通過(guò)離心和濁度測(cè)定方法不能檢測(cè)到膠原聚集體的形成［15］。由此推斷，羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集的臨界濃度為0.23～0.34 mg/mL。

圖1 不同濃度下羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)曲線（a）及線性擬合關(guān)系（b）Fig.1 The kinetic self-assembly curves（a）and linear fitting relationships（b）of type Ⅰ collagen from tilapia skin with different concentrations

為進(jìn)一步研究不同濃度膠原的自聚集動(dòng)力學(xué)，運(yùn)用式（2）對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得結(jié)果如圖1（b）所示。可以看出膠原的自聚集過(guò)程可分為兩個(gè)階段，其分界點(diǎn)對(duì)應(yīng)于溶液吸光度開(kāi)始顯著增大的時(shí)間，如圖1（a）所示，這與膠原的成核-生長(zhǎng)理論［16］相對(duì)應(yīng)，說(shuō)明運(yùn)用式（2）對(duì)膠原自聚集動(dòng)力學(xué)進(jìn)行解析是合理的。因此，可以認(rèn)為膠原自聚集過(guò)程的第一和第二階段分別為其成核階段和生長(zhǎng)階段［7］；兩階段分界點(diǎn)對(duì)應(yīng)的時(shí)間可認(rèn)為是膠原的成核時(shí)間。圖1（b）還表明隨著濃度的增大，膠原的成核時(shí)間逐漸降低，表明膠原分子越多，越容易自聚集形成晶核。膠原自聚集兩階段的聚集速率常數(shù)可通過(guò)最小二乘法得到，結(jié)果如表1所示。隨著膠原濃度的增大，成核階段的速率常數(shù)逐漸增大，進(jìn)一步說(shuō)明膠原分子越多越有利于晶核的形成。但生長(zhǎng)階段的聚集速率常數(shù)隨著膠原濃度的增大呈現(xiàn)先升高后降低的特點(diǎn)，在膠原濃度為0.94 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值，表明適量的膠原分子能促進(jìn)纖維的生長(zhǎng)，但過(guò)多卻產(chǎn)生抑制作用。

表1 不同濃度下羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集速率常數(shù)Table1 The rate constant of typeⅠcollagen self-assembly from tilapia skin with different concentrations

2.2 溫度對(duì)羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)的影響

溫度對(duì)羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)的影響如圖2（a）和表2所示。經(jīng)Boltzmann函數(shù)擬合發(fā)現(xiàn)，膠原在20℃和37℃條件下也可發(fā)生明顯的自聚集，并且與在30℃時(shí)自聚集類似，其聚集過(guò)程也分為兩個(gè)階段，但是自聚集參數(shù)卻隨著溫度的不同而不同。在自聚集溫度為30℃時(shí)，膠原的成核時(shí)間明顯短于在其他溫度下，且其自聚集速率常數(shù)也較高，表明羅非魚(yú)皮膠原在30℃時(shí)較易自聚集，這可能與膠原原料的生活溫度有關(guān)。羅非魚(yú)的最適生活溫度為28～30℃［17］，由此可以認(rèn)為自聚集溫度越接近于動(dòng)物的生活溫度，由其來(lái)源的膠原的自聚集能力越強(qiáng)，這與在草魚(yú)魚(yú)鱗膠原自聚集研究上得到的結(jié)果是一致的［9］。

2.3 溶液pH對(duì)羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)的影響

圖2 不同溫度下羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)曲線（a）及線性擬合關(guān)系（b）Fig.2 The kinetic self-assembly curves（a）and linear fitting relationships（b）of type Ⅰ collagen from tilapia skin at different temperatures

表2 不同溫度下羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集速率常數(shù)Table2 The rate constant of type Ⅰ collagen self-assembly from tilapia skin at different temperatures

不同溶液pH下，羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)擬合曲線如圖3（a）和表3所示，可以看出膠原在pH5.4～9.4的范圍內(nèi)均能夠發(fā)生明顯的自聚集，與牛皮Ⅰ型膠原的研究結(jié)果一致［18］。采用式（2）對(duì)擬合曲線進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3（b）和表3所示。當(dāng)溶液pH為7.4、8.4和9.4時(shí)，膠原的成核時(shí)間明顯短于pH為5.4和6.4時(shí)；隨著溶液pH由5.4增大到9.4，膠原自聚集成核階段的速率常數(shù)逐漸增大，生長(zhǎng)階段的速率常數(shù)先增大后降低，在pH7.4時(shí)達(dá)到最大值。上述結(jié)果表明羅非魚(yú)皮膠原在堿性條件下自聚集能力較強(qiáng)，這主要與其等電點(diǎn)有關(guān)［3］。

圖3 不同pH下羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)曲線（a）及線性擬合關(guān)系（b）Fig.3 The kinetic self-assembly curves（a）and linear fitting relationships（b）of typeⅠcollagen from tilapia skin at different pH values

2.4 溶液離子強(qiáng)度對(duì)羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)的影響

圖4 不同NaCl濃度下羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)曲線（a）及線性擬合關(guān)系（b）Fig.4 The kinetic self-assembly curves（a）and linear fitting relationships（b）of typeⅠcollagen from tilapia skin at different NaCl concentrations

表3 不同pH下羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集速率常數(shù)Table3 The rate constant of type Ⅰ collagen self-assembly from tilapia skin at different pH values

在不同離子強(qiáng)度（NaCl濃度）下，羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集動(dòng)力學(xué)曲線如圖4（a）所示，擬合Boltzmann函數(shù)如表4所示。可以看出當(dāng)自聚集溶液中有NaCl存在時(shí)，膠原表現(xiàn)明顯的自聚集現(xiàn)象（R2＞0.9），但是若溶液中沒(méi)有NaCl存在，膠原并未表現(xiàn)明顯的自聚集過(guò)程（R2=0.66）。由此可以得出：NaCl在膠原的自聚集過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這與Li和Douglas在牛膠原自聚集性上的研究結(jié)果類似［13］，但是與狹鱈魚(yú)皮膠原上的結(jié)果不同［7］，可能是由聚集溫度不同導(dǎo)致的。利用式（2）對(duì)膠原自聚集動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4（b）和表4。隨著溶液中NaCl濃度的增大，膠原的成核時(shí)間明顯縮短，原因可能是NaCl通過(guò)屏蔽帶電基團(tuán)而降低了膠原分子間的斥力［19］。另外，隨著溶液中NaCl濃度的增大，膠原自聚集成核階段的速率常數(shù)是逐漸增大的；而生長(zhǎng)階段的速率常數(shù)在NaCl濃度由32.5 mmol/L增大到130 mmol/L時(shí)是增大的，但是繼續(xù)增大NaCl濃度，其值是降低的，表明在聚集溶液中適度加入NaCl有利于膠原的自聚集，但是過(guò)量的NaCl卻阻礙了膠原纖維的生長(zhǎng)。

表4 不同NaCl濃度下羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原自聚集速率常數(shù)Table4 The rate constant of type Ⅰ collagen self-assembly from tilapia skin at different NaCl concentrations

3 結(jié)論

羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原具有體外自聚集能力，其自聚集過(guò)程表現(xiàn)為兩個(gè)階段：成核階段和生長(zhǎng)階段。膠原濃度、溫度、溶液pH和離子強(qiáng)度（NaCl濃度）均能夠影響到羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原的自聚集動(dòng)力學(xué)。膠原或NaCl濃度越高越有利于膠原晶核的形成，但是濃度過(guò)高卻對(duì)膠原纖維的生長(zhǎng)有阻礙作用；聚集溫度越接近膠原來(lái)源原料的生活溫度或溶液pH偏堿性，膠原越容易自聚集。因此可通過(guò)調(diào)控膠原的聚集條件來(lái)調(diào)控其自聚集過(guò)程，進(jìn)一步對(duì)聚集體形態(tài)進(jìn)行調(diào)控，這對(duì)于海洋Ⅰ型膠原生物材料和食品包裝材料的研究和開(kāi)發(fā)具有非常重要的意義。后續(xù)研究將著重探討聚集條件對(duì)膠原聚集體形態(tài)和功能的調(diào)控作用。

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Effect of the aggregation conditions on the kinetic self-assembly of typeⅠcollagen from tilapia（Oreochromis niloticus）skin

YAN Ming-yan，QIN Song*
（Yantai Institute of Coastal Zone Research，Chinese Academy of Sciences，Yantai 264003，China）

The effects of collagen concentration，temperature，pH value and ionic strength on the kinetic self-assembly of type Ⅰ collagen from tilapia（Oreochromis niloticus）skin were investigated by Boltzmann function and a two-phase kinetic self-assembly model（nucleation phase and growth phase）.It showed that the kinetic self-assembly of collagen could be modulated by collagen concentration，temperature，pH value and ionic strength.The marked self-assembly was formed when the concentration of collagen reaching and above 0.34 mg/mL from the fitted kinetic self-assembly curve.More of collagen molecules were beneficial for the formation of nucleus，but excess would inhibit the growth of fibril.Collagens were more likely to self-assemble when the temperature was close to the environmental temperature for samples or in the alkaline solution.Finally，the collagen self-assembly could be modulated by NaCl concentration.The higher NaCl concentration was beneficial to the formation of nucleus，but the superabundant of NaCl would inhibit the growth of fibril.

collagen；self-assembly；tilapia；fish skin；kinetic

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0093-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.010

2015-05-06

閆鳴艷（1980-），女，博士，助理研究員，研究方向：海洋生物活性物質(zhì)及其功能特性研究，E-mail：mingyan012003@163.com。

*通訊作者：秦松（1968-），男，博士，研究員，研究方向：海岸帶生物活性物質(zhì)及其功能特性研究，E-mail：sqin@yic.ac.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31201455，41576155）；山東省海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范產(chǎn)業(yè)項(xiàng)目（海洋活性蛋白及其功能制品的開(kāi)發(fā)與產(chǎn)業(yè)化）。