腰果蛋白的功能特性研究及其氨基酸組成分析

劉成梅，王 芳，鐘俊楨，熊 洋，頓儒艷，鐘業俊（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047）

腰果蛋白的功能特性研究及其氨基酸組成分析

劉成梅，王 芳，鐘俊楨*，熊 洋，頓儒艷，鐘業俊
（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047）

采用堿提法最優條件提取并酸沉得到腰果蛋白，研究了pH和溫度對腰果蛋白的溶解性、起泡性及起泡穩定性、乳化性及乳化穩定性、持油性等功能特性的影響，并分析了腰果蛋白的氨基酸組成。結果表明：腰果蛋白的溶解性隨pH的增加呈先降低后升高的趨勢，在pH4附近溶解度最低，僅為15.90%。起泡性和乳化性隨pH的變化曲線與溶解度曲線一致，在pH10時起泡性和乳化性最好，分別為13.92%、24.70 m2/g。腰果蛋白的起泡穩定性隨pH的增加而逐漸增加，在pH8時達到最大為9.42%，而后趨于穩定。在堿性環境中，腰果蛋白會表現出較好的乳化穩定性，并且在80℃時其持油性最佳，為2.84 g/g。氨基酸分析表明，腰果蛋白中含有17種氨基酸，其中7種是人體必需氨基酸，含量皆高于FAO/WHO/UNO成人推薦標準，賴氨酸為第一限制性氨基酸，谷氨酸和精氨酸含量最高，分別為22.46%和9.02%。

腰果蛋白，功能特性，pH，氨基酸組成

腰果（Anacardium occidentale Linnaeus）為漆樹科腰果屬，多年生熱帶常綠喬木，熱帶重要干果和油料樹種，其果仁是世界著名的四大果仁之一，深受世界人們喜愛［1］。腰果仁是腰果的真果部分，果仁中含有大約48%的脂肪，其中油酸和亞油酸的比例高達73.4%和11.9%，是一種高級的食用油脂［2］。除了豐富的脂肪含量外，腰果種仁中還含有21%的蛋白質和各種微量元素，如磷、鉀、鎂、鐵等［3］。榮瑞芬等［4］通過對幾種重要堅果的營養性分析發現腰果蛋白的氨基酸模式與人體氨基酸模式非常接近，是一種價值很高的優質蛋白質。

近些年來，隨著人們對蛋白質需求量的大幅度增加，動物蛋白由于其昂貴的價格等諸多原因已經不能滿足人們日益增長的需要。相比于動物蛋白，植物蛋白不僅資源豐富，價格低廉，而且還具有必需氨基酸含量較高，不含膽固醇等特點，可作為動物蛋白的替代物補充到人體中［5］。目前國內外已有許多關于植物蛋白開發利用的報道，其中包括蛋白提取工藝、功能特性等的研究［6-7］，而關于腰果有不少報道主要集中在對腰果仁油的提取和分析上［8-9］，對提油后產生的果粕中的蛋白質的功能性還鮮有研究。

在食品加工、儲存、運輸、生產過程中，蛋白質的功能性質對其起著重要作用［10］。影響蛋白質功能性質的因素一般有蛋白質的本身性質（如氨基酸組成、結構、分子大小）及蛋白質所處的環境（如溫度、pH、離子強度）等［11］。在本課題組的前期研究［12］中，已對腰果蛋白的提取工藝進行了優化，得出了腰果蛋白提取的最佳工藝條件。在此基礎上，本實驗通過進一步深入研究不同pH和溫度對腰果蛋白功能特性的影響及氨基酸組成，以期為腰果蛋白在食品加工中的開發和利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生腰果 購于南昌洪城大市場，儲存于0～4℃；金龍魚食用調和油 益海嘉里糧油食品有限公司；考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、十二烷基硫酸鈉（SDS） 生工生物工程有限公司，分析純；石油醚天津市大茂化學試劑廠，分析純。

UV-1600PC紫外分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；L-8800型氨基酸分析儀 日本日立有限公司；LXJ-IIBB高速離心機 上海安亭科學儀器廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇榮華儀器制造有限公司；JJ-931型磁力攪拌器 江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠；FE20 METTLER TOLEDO pH計 江西博力儀器設備有限公司；IKA-WERKE高速分散機 上海柏欣儀器設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 腰果蛋白的制備 本實驗采用堿提法最佳提取工藝條件結合酸沉淀制備腰果蛋白［12］，即腰果粉碎后以1∶10的料液比與沸程60～90℃的石油醚混合并在磁力攪拌器上攪拌10 h，真空抽濾除去油脂，脫脂過程重復3次，將脫脂后的腰果粉置于通風處揮干石油醚。取100 mg脫脂腰果粉，在料液比1∶40、pH9、溫度35℃下提取1.5 h，于4000 r/min離心15 min，將得到的上清液調pH至4.5，靜置2 h后再次離心（4000 r/min，15 min），沉淀水洗除雜，真空冷凍干燥后，即得到純度為87.37%的腰果蛋白。

1.2.2 腰果蛋白溶解性的測定 根據Deng等［13］的方法，分別稱取50 mg腰果蛋白溶于25 mL去離子水中，用0.1 mol/L的HCl或NaOH將上述蛋白溶液分別調pH 至2、4、6、8、10，室溫磁力攪拌1 h后，4800 r/min離心20 min，上清液蛋白含量采用考馬斯亮藍法以牛血清白蛋白做標準進行測定，實驗重復三次。

1.2.3 腰果蛋白起泡性和起泡穩定性的測定 根據杜蕾蕾等［14］的方法，分別稱取50 mg腰果蛋白溶于25 mL去離子水中，用0.1 mol/L的HCl或NaOH將上述蛋白溶液分別調pH至2、4、6、8、10，于10000 r/min下高速分散1 min，記錄分散停止時泡沫體積，靜置30 min后再次測定泡沫體積，計算起泡穩定性。

1.2.4 腰果蛋白乳化性和乳化穩定性的測定 根據Darine等［7］的方法，分別稱取50 mg腰果蛋白溶于25 mL去離子水中，用0.1 mol/L的HCl或NaOH將上述蛋白溶液分別調pH至2、4、6、8、10，然后緩緩加入5 mL大豆色拉油，在10000 r/min高速分散機下分散1 min制成乳狀液，用移液槍從底部吸取乳狀液50 μL，立即與5 mL 0.1%SDS（0.1 g加水定容100 mL）混合，然后用分光光度計于500 nm處測其吸光度A0，25 min后再測一次At。其乳化性及乳化穩定性的計算公式如下：

式中：C—蛋白質濃度（g/mL）；?—乳化液中油的體積分數（0.25）。

式中：t—兩次測定吸光度的時間間隔（min）。

1.2.5 腰果蛋白持油性的測定 根據杜蕾蕾等［14］的方法，準確稱量0.5 g腰果蛋白于離心管中，測定其總質量，然后加入10 mL大豆色拉油，用高速組織搗碎機混合1 min，分別置于20、40、60、80、100℃下水浴30 min，離心沉降（4000 r/min）20 min，小心除去上層油后稱重。腰果蛋白持油性的計算公式如下：

式中：W—樣品的質量（g）；W1—吸油前樣品和離心管總重量（g）；W2—吸油后樣品和離心管總重量（g）。

1.2.6 腰果蛋白的氨基酸分析 參考文獻［15］，稱取100 mg腰果蛋白，用5 mL 6 mol/L的鹽酸在110℃真空條件下水解24 h，將水解液定容至50 mL。取20 μL水解液，采用氨基酸分析儀測定腰果蛋白氨基酸組成。色譜柱：4.6 mm×60 mm陽離子交換樹脂柱；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫液A：0.36 mol/L檸檬酸鈉溶液（pH3.45）；洗脫液B：0.6 mol/L檸檬酸鈉溶液（pH10.85）；洗脫液流速：0.45 mL/min；茚三酮溶液流速：0.25 mL/min；柱溫：58～74℃梯度控溫；檢測波長（脯氨酸除外）：570 nm，脯氨酸檢測波長：440 nm。

1.2.7 統計分析 所有實驗重復三次，使用SPSS 19.0進行方差分析，作圖采用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 不同pH對腰果蛋白溶解性的影響

溶解性是蛋白質的“第一必需”性質，主要受pH、離子強度、溫度、溶劑類型等因素的影響。如圖1所示，pH-溶解度曲線基本呈現“U”字型，這與大部分蛋白質溶解曲線類似［6］。在pH2～4范圍內，溶解度隨pH的上升而降低，并在pH4時達到最低，僅為15.90%，其中pH2時腰果蛋白的溶解度為63.41%，當pH在4～10之間時，溶解度隨pH的增加而增加，在pH10時最大，為79.39%。

蛋白質較低的溶解度常發生在等電點附近，這是由于在等電點周圍，蛋白質分子表面電荷為零，分子間靜電斥力減小，促使蛋白質相互聚集［16］，另一方面是由于蛋白質分子間疏水相互作用增強也使得蛋白質發生聚集而沉淀［17］。在本實驗中腰果蛋白在pH4時溶解度最低，可以推測出腰果蛋白的等電點可能在pH4附近。而當pH遠離等電點時，蛋白質帶正或負凈電，其靜電排斥和離子水化作用增加，導致蛋白質分子之間不易聚集，從而增加了蛋白質的溶解度。

圖1 pH對腰果蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of pH on the solubility of cashew nuts protein

2.2 不同pH對腰果蛋白起泡性及起泡穩定性的影響

圖2 pH對腰果蛋白起泡性的影響Fig.2 Effect of pH on the foaming of cashew nuts protein

蛋白質含有親水和疏水基團，具有典型的兩親結構，因此可以起到降低界面張力的作用［18］。從圖2中可以看出腰果蛋白的起泡性隨pH升高呈現先降低后升高的趨勢，與溶解度的變化趨勢一致。在pH4時，腰果蛋白起泡性最低，為10.2%，這可能是由于蛋白質在發揮起泡性前，首先要溶解，快速移動并吸附在氣-液界面，而在pH4時蛋白質的溶解度較低，只有較少的可溶性蛋白參與到起泡過程中［19］。在pH6、8、10下腰果蛋白的起泡性分別為11.88%、13.33%、13.92%，這可能因為偏離等電點，腰果蛋白溶解度升高，溶液中有效的蛋白質含量增加，吸附到氣-液界面的蛋白質分子增多，有利于界面性質發揮；另一方面在較強的酸堿條件下，蛋白質分子帶有更多的靜電荷，使得靜電斥力增加，降低了氣泡的合并，削弱了疏水相互作用，蛋白質分子柔性增加，有利于蛋白質分子快速的吸附到界面，并展開重排［20］。

蛋白質的泡沫穩定性主要由其粘度、分子間相互作用等物理特性決定［21］。如圖3所示，在pH2～4之間，腰果蛋白的起泡穩定性沒有顯著性差異（p＞0.05），起泡穩定性相對較低。隨著pH增加，起泡穩定性也逐漸增加，當pH達到8時，腰果蛋白的起泡穩定性達到最大，為9.42%。而pH繼續增加時，腰果蛋白的起泡穩定性沒有顯著性的提升（p＞0.05）。這說明腰果蛋白在較酸或較堿環境下起泡穩定性趨于穩定，隨著pH的增加，腰果蛋白的起泡穩定性整體呈現不斷增加的趨勢。這可能是由于隨著pH的增加，腰果蛋白的溶解度增加，促進了蛋白質分子在界面形成緊密的，有粘合力的多分子層，導致粘度增加，從而增加了泡沫的穩定性［20］。

圖3 pH對腰果蛋白起泡穩定性的影響Fig.3 Effect of pH on the foaming stability of cashew nuts protein

2.3 不同pH對腰果蛋白乳化性及乳化穩定性的影響

圖4 pH對腰果蛋白乳化性的影響Fig.4 Effect of pH on the emulsification of cashew nuts protein

乳化特性是利用蛋白質分子結構中的親水和親油基團，吸附在油-水界面上，形成一層膜，從而阻止油滴的聚集，達到穩定乳化的作用。蛋白質在不同pH下，溶解性和內部電荷都是不同的，一般來說蛋白質乳化性隨著表面電荷和蛋白質溶解性的增加而增強［22］。由圖4可知，水溶液pH在2～4之間時，腰果蛋白質的乳化性隨著pH的增高而減小，在等電點處降至最低，為13.60 m2/g。這是因為大多數食物蛋白在其等電點處溶解度較低水合作用不佳，缺乏靜電排斥力，蛋白質不能迅速地移動到油-水界面，造成乳化性低［23］。隨著pH由4～10繼續增大時，乳化性逐漸上升，在pH10時達到最大，為24.70 m2/g。這可能是因為在堿性pH下，蛋白質所帶凈電荷增加，疏水力降低，且蛋白質分子柔性增加，使蛋白質分子可以迅速擴散到油-水界面，導致乳化性增加。

由圖5可知，在pH2～4時腰果蛋白的乳化穩定性隨著pH的增加而降低，當溶液pH處在4～6之間時，腰果蛋白的乳化穩定性沒有顯著性差異（p＞0.05），呈現出較差的乳化穩定性；繼續增加pH，腰果蛋白乳化穩定性不斷升高，并在pH8時，乳化穩定性達到最高，為16.71 min；之后升高pH對腰果蛋白的乳化穩定性沒有顯著性提升（p＞0.05）。由此可以發現隨著pH的增加，乳化穩定性整體呈先降低后升高的趨勢，pH-乳化性曲線與溶解度曲線相似。一些研究發現表明蛋白質的乳化特性和溶解性通常呈正相關［24］。

圖5 pH對腰果蛋白乳化穩定性的影響Fig.5 Effect of pH on the emulsion stability of cashew nuts protein

2.4 不同溫度下腰果蛋白持油性的差異

圖6 溫度對腰果蛋白持油性的影響Fig.6 Effect of temperature on the oil absorption

蛋白質的持油性是指蛋白質與游離油脂相結合的能力，它與蛋白質的種類、來源、加工方法、溫度及所用的油脂等有關［25］。本實驗主要研究了不同溫度下腰果蛋白的吸油性。由圖6可知，腰果蛋白在20～40℃時，持油性隨溫度的增加而升高，在40～60℃時，腰果蛋白持油性沒有顯著性差異（p＞0.05）。當溫度繼續升高至80℃時，持油性達到最高為2.84 g/g，當溫度超過80℃時，腰果蛋白的持油性略有下降（p＜0.05）。可以看出腰果蛋白的持油性隨溫度的升高，整體呈現升高的趨勢。這是因為蛋白質的吸油性取決于蛋白質的構象、親水親油基團的平衡，加熱可能會引起蛋白質亞基的解聚，親油基團暴露，造成持油性升高［26］。

2.5 腰果蛋白氨基酸組分分析

蛋白質的營養價值在一定程度上取決于氨基酸的組成。由于實驗前處理過程中采用酸水解，因此色氨酸含量未進行檢測［27］，其余氨基酸含量如表1所示。從表1中可知，腰果蛋白氨基酸除色氨酸外，富含17種氨基酸，7種是人體必需氨基酸，含量為29.92%，占氨基酸總量的31.62%，其中谷氨酸、精氨酸在17種氨基酸中含量最高，分別為22.46%和9.02%。與FAO/ WHO/UNO推薦值相比，腰果蛋白所含氨基酸都能滿足成人的需要，而賴氨酸、含硫氨基酸（甲硫氨酸和半胱氨酸）、含苯環氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸）、組氨酸不能滿足兒童的需求。在腰果蛋白中酸性、堿性、疏水性氨基酸分別占氨基酸總量的29.04%、14.60%、39.37%，表明腰果蛋白是一種酸性蛋白質。根據氨基酸評分值發現賴氨酸為腰果蛋白的第一限制性氨基酸，這與Venkatachalam等［28］的報道一致，而在Aremu等［29］的研究中發現纈氨酸是腰果蛋白的第一限制性氨基酸，這可能是由于腰果生長環境的不同、品種的差異對結果造成的差異。

表1 腰果蛋白氨基酸含量Table1 Amino acid content of cashew nut protein

3 結論

腰果蛋白的溶解性隨pH變化曲線呈“U”字型，在pH4附近溶解性最低，僅有15.90%，腰果蛋白的起泡性和乳化性隨pH的變化曲線與溶解度曲線一致，在pH10下，起泡性和乳化性最好，分別為13.92%、24.70 m2/g。起泡穩定性隨pH的增加不斷增加，最后趨于穩定，乳化穩定性隨pH的變化總體呈現先降低后升高的趨勢。在80℃時，腰果蛋白的持油性最好，為2.84 g/g。氨基酸分析表明：除色氨酸外，腰果蛋白中富含17種氨基酸，其中包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸等7種人體必需氨基酸，且含量均高于FAO/WHO/ UNO成人推薦標準。非必需氨基酸中谷氨酸和精氨酸的含量較高，分別為22.46%和9.02%。腰果蛋白作為一種優質的植物蛋白資源，具有極大的開發潛力。

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Functional properties and amino acid composition of cashew nut protein

LIU Cheng-mei，WANG Fang，ZHONG Jun-zhen*，XIONG Yang，DUN Ru-yan，ZHONG Ye-jun
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

The cashew nut protein was prepared under the optimized conditions via alkali extraction and acid precipitation method，while the effects of pH and temperature on the solubility，foaming and foaming stability，emulsification and emulsion stability，oil absorption were investigated and the amino acids composition of cashew nut protein also had been analyzed.The results showed that the solubility of cashew nut protein decreased first and then increased with the increase of pH，while the minimum solubility was found to be 15.90%at pH4.Foaming and emulsification profiles of cashew nut protein were consistent with the solubility profiles.The maximum foaming and emulsification of 13.92%，24.70 m2/g were obtained at pH10 respectively.Foaming stability of cashew nut protein were gradually increased with the increase of pH and reached the maximum（9.42%）at pH8.In alkaline environment，cashew nut protein showed a better emulsion stability.Cashew nut protein obtained the best oil absorption（2.84 g/g）at 80℃.Amino acid analysis showed the cashew nut protein contains 17 kinds of amino acids which 7 kinds were the essential amino acids.The content of amino acids all were higher than the standard recommended by FAO/WHO/UNO for adults while lysine was the first limited amino acid and glutamic acid，arginine were the most abundant，respectively 22.46%and 9.02%.

cashew nut protein；functional properties；pH；amino acids composition

TS255.1

A

1002-0306（2016）02-0088-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.009

2015－05－04

劉成梅（1963-），男，博士，教授，研究方向：食物資源利用與開發，E-mail：916504978@qq.com。

*通訊作者：鐘俊楨（1984-），女，博士，副研究員，研究方向：食品科學與工程，E-mail：zhongjunzhen@163.com。

公益性行業（農業）科研專項（201303077）。