超聲輔助分散液液微萃取-高效液相色譜法測定蜂蜜中溴氰菊酯殘留

于玲（邢臺(tái)學(xué)院化學(xué)工程與生物技術(shù)學(xué)院，河北邢臺(tái)054001）

超聲輔助分散液液微萃取-高效液相色譜法測定蜂蜜中溴氰菊酯殘留

于玲
（邢臺(tái)學(xué)院化學(xué)工程與生物技術(shù)學(xué)院，河北邢臺(tái)054001）

采用超聲輔助分散液液微萃取技術(shù)結(jié)合高效液相色譜法測定蜂蜜中的溴氰菊酯。蜂蜜樣品用乙腈∶水（1∶4，v/v）混合溶液提取，加入氯仿萃取，超聲，離心，得到沉積相，進(jìn)行HLPC分析。溴氰菊酯在10～1000 μg/kg范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，富集倍數(shù)高達(dá)600倍。當(dāng)蜂蜜樣品的加標(biāo)濃度為10、50、100 μg/kg時(shí)，加標(biāo)回收率為82.6%～97.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～3.8%。蜂蜜樣品中溴氰菊酯的檢出限為8 μg/kg，定量限為40 μg/kg。本方法具有簡便快捷、準(zhǔn)確靈敏、萃取效率高、有機(jī)溶劑消耗少等特點(diǎn)，可成功地應(yīng)用于蜂蜜中溴氰菊酯殘留的測定。

分散液液微萃取，高效液相色譜法，溴氰菊酯，蜂蜜

溴氰菊酯俗稱敵殺死，是目前殺蟲活性最高的殺蟲劑之一，可有效防治糧、棉、油、果、菜、茶等多種農(nóng)作物、經(jīng)濟(jì)林木上的害蟲。但由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易分解，長期在自然環(huán)境中遷移、富集，各種環(huán)境介質(zhì)、動(dòng)植物及人體內(nèi)仍可檢出，殘留問題十分嚴(yán)重。

蜂蜜是一種傳統(tǒng)的天然保健食品，具有補(bǔ)中，潤燥，止痛，解毒之功效，常被用來直接飲用或制作成飲料和糕點(diǎn)等食品，由于其香甜可口而備受人們青睞。蜂蜜是蜜蜂從開花植物的花中采得的花蜜在蜂巢中釀制而成的。然而蜜源植物和蜜蜂體內(nèi)的農(nóng)藥殘留可能污染蜂蜜，從而危害人體健康［1］。近年來，歐盟等國家和地區(qū)一再對(duì)蜂蜜產(chǎn)品設(shè)置極為嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，但主要是針對(duì)蜂蜜中的除螨劑。我國也僅是對(duì)蜂蜜中氟胺氰菊酯、氟氯苯氰菊酯、溴螨酯等除螨劑作出了最大殘留限量的限定。對(duì)使用更為廣泛的殺蟲劑，尤其是占?xì)⑾x劑使用比例較大的溴氰菊酯，無論國際還是國內(nèi)檢測組織對(duì)其最大殘留限量均沒有規(guī)定。這無疑成為了對(duì)蜂蜜質(zhì)量嚴(yán)控和把關(guān)的漏洞。嚴(yán)格監(jiān)測蜂蜜中溴氰菊酯的殘留關(guān)系到消費(fèi)者健康，并能直接反映出環(huán)境本底的農(nóng)藥污染狀況。可見，相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定勢在必行，因此，建立一種簡便高效的測定蜂蜜中溴氰菊酯的方法尤為重要。

測定溴氰菊酯的主要方法有氣相色譜法（GC）［2］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）［3-4］、液相色譜法（HPLC）［5］和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）［6］等。進(jìn)樣前所使用的樣品前處理技術(shù)主要是索氏提取［7］、微波輔助提取［8］、固相萃取［9］以及液液萃取［10-11］，這些處理方法耗費(fèi)大量的有毒有害有機(jī)溶劑、操作繁瑣耗時(shí)，結(jié)果誤差偏大。分散液液微萃取（DLLME）是由Rezaee［12］于2006年首次提出的一種新型樣品前處理技術(shù)，集采樣、萃取和濃縮于一體，是一種操作簡單、快速、成本低、富集效率高且對(duì)環(huán)境友好的樣品前處理新技術(shù)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前分散液液微萃取處理的樣品大多數(shù)為簡單基質(zhì)（如水樣）［13-15］，而對(duì)復(fù)雜樣品中低含量成分的測定鮮有報(bào)道。蜂蜜中含有糖類、有機(jī)酸、維生素等180多種物質(zhì)，基質(zhì)復(fù)雜，本文在DLLME基礎(chǔ)上輔以超聲技術(shù)，提高萃取效率，并與高效液相色譜聯(lián)用，建立了測定蜂蜜中溴氰菊酯殘留的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

溴氰菊酯（純度98%） 上海市農(nóng)藥研究所；二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、四氯乙烷、四氯化碳、氯苯、二硫化碳、甲醇、丙酮、乙醇、乙腈 分析純，北京化工廠；流動(dòng)相中使用的乙腈 色譜純；實(shí)驗(yàn)用水 超純水；實(shí)驗(yàn)過程中所用的柑橘蜜、黨參蜜、荔枝蜜、洋槐蜜、紫云英蜜、枸杞蜜、椴樹蜜、野桂花蜜、棗花蜜、益母草蜜和荊條蜜等11種，33個(gè)樣品（每一種蜂蜜選擇3個(gè)樣品） 均為市售蜂蜜。

LC-20AT高效液相色譜儀，配SPD-M20A二極管陣列檢測器 日本島津公司；SC-36112型低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Exceed-Ad-24型超純水機(jī) 成都艾柯水處理設(shè)備有限公司；KQ-50B型超聲波清洗器 天津市瑞普電子儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 WondaSilTM C18色譜柱（25 cm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（88∶12，v/v），流速：1 mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：230 nm，進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取10 mg溴氰菊酯對(duì)照品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻，配成100 μg/mL溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用時(shí)用水稀釋至所需的濃度。

1.2.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取蜂蜜5 g，用乙腈∶水（1∶4，v/v）混合溶液稀釋至50 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾，備用。取濾液5 mL加入5 mL帶刻度尖底玻璃離心管中，用移液槍快速注入20 μL氯仿萃取劑，劇烈振蕩混勻，使萃取劑均勻地分散在水相中，形成水/分散劑/萃取劑的乳濁液體系，超聲3 min（功率60 W），以3500 r/min離心5 min，萃取劑沉積在離心管底部，然后用微量進(jìn)樣器吸取5 μL沉積相，進(jìn)行HPLC分析測定。

1.2.4 條件優(yōu)化樣品溶液的配制 取不含溴氰菊酯的益母草蜂蜜樣品，加入一定體積的100 μg/mL溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法配制成終含量為0.05 μg/mL的蜂蜜樣品溶液，供條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.5 工作曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取7份1 g不含溴氰菊酯的益母草蜂蜜試樣，分別加入一定體積的溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈∶水（1∶4，v/v）混合溶液稀釋至50 mL，使其濃度分別為10、25、50、100、250、500、1000 μg/kg，按1.2.3進(jìn)行樣品前處理后，上機(jī)分析做基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 方法回收率計(jì)算公式 回收率是萃取后有機(jī)相中的分析物含量相對(duì)樣品中所有分析物含量的百分比，即：

式中，ER為回收率，C0為萃取后分析物在有機(jī)相中的濃度（μg/mL），C為萃取前分析物在樣品水溶液中的濃度（μg/mL），V0為萃取后有機(jī)相體積（mL），V為萃取前水相體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助分散液相微萃取方法的優(yōu)化

2.1.1 萃取劑的種類 采用乙腈∶水（1∶4，v/v）制備的0.05 μg/mL溴氰菊酯的蜂蜜樣品溶液5 mL，分別與20 μL不同萃取劑（氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、二硫化碳、氯苯、二氯乙烷、四氯乙烷）進(jìn)行微萃取實(shí)驗(yàn)，見圖1。結(jié)果表明：采用氯仿作萃取劑時(shí)，峰形極佳而且吸收很強(qiáng)，回收率最高；二氯甲烷作萃取劑時(shí)無沉積相；其他5種萃取劑回收率都較低，不適合分析測定。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用氯仿作為萃取劑。

圖1 萃取劑種類的選擇Fig.1 Selection of extraction agent

圖2 萃取劑體積的選擇Fig.2 Selection of extraction solvent volume

2.1.2 萃取劑的體積 采用乙腈∶水（1∶4，v/v）配制的0.05 μg/mL溴氰菊酯的蜂蜜樣品溶液5 mL，選擇不同體積的氯仿（10、20、30、40、50 μL）做微萃取實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：隨著萃取劑用量的增加，沉積相體積逐漸增多，相應(yīng)的萃取相中溴氰菊酯的濃度逐漸降低，方法回收率也呈現(xiàn)同樣的趨勢，結(jié)果見圖2。當(dāng)采用10 μL氯仿時(shí)，由于溶解損失，離心后無沉積相，所以不適合做最終的體積；當(dāng)氯仿加入量為20 μL時(shí)，既可以保持較高回收率，也能滿足進(jìn)樣測定所需的體積，再增加萃取劑用量，萃取回收率隨之下降，所以氯仿體積選擇20 μL。

2.1.3 分散劑的種類 分散劑種類對(duì)萃取過程中的回收率影響較大。分別采用乙腈、甲醇、丙酮、乙醇等4種分散劑和水的比例為1∶4制備蜂蜜樣品溶液，取樣品溶液5 mL，分別加入20 μL氯仿進(jìn)行微萃取實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：以乙腈作為分散劑時(shí)，回收率最高，為89.3%，萃取效果最好；其次是丙酮，回收率為60.9%。以甲醇和乙醇為分散劑時(shí)，沒有沉積相，不能形成兩相系統(tǒng)，這可能與其較大的溶解性有關(guān)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈為分散劑。

2.1.4 提取溶劑的選擇和分散劑的關(guān)系 通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溴氰菊酯不溶于水，為了提高水溶液對(duì)蜂蜜樣品中溴氰菊酯的提取率，需在水中加一定量的有機(jī)溶劑。由于分散劑為乙腈，為了保證溶劑體系的一致，因此選用乙腈-水混合溶液對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行提取。同時(shí)又研究了乙腈-水混合溶液對(duì)蜂蜜樣品萃取效率的影響，實(shí)驗(yàn)分別采用1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6等5組不同體積比的乙腈-水混合溶液提取蜂蜜樣品，并向5 mL樣品溶液中加入20 μL氯仿進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)，如圖3。結(jié)果表明：當(dāng)乙腈-水比例為1∶2時(shí)，沒有沉積相；乙腈-水比例為1∶3時(shí)，沉積相不足5 μL，精密度較差；在乙腈-水比例為1∶4時(shí)，回收率達(dá)到最大，隨后乙腈-水比例從1∶4變到1∶6時(shí)，分散劑（乙腈）比例不斷減少，萃取劑未能均勻的分散在水相中，導(dǎo)致回收率降低。實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-水比例為1∶4。

圖3 乙腈-水比例的選擇Fig.3 Selection of acetonitrile-water ratio

2.1.5 樣品體積 樣品體積的多少對(duì)萃取效果也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。分別采用乙腈∶水（1∶4，v/v）制備的溴氰菊酯蜂蜜樣品溶液3、4、5、6、7、8、9 mL，分別加入20 μL氯仿進(jìn)行微萃取實(shí)驗(yàn)，見圖4。結(jié)果表明：蜂蜜樣品溶液體積在3～5 mL時(shí)，回收率逐漸增加，這是因?yàn)楦嗟臉悠啡芤嚎梢蕴峁┒嘁恍┑哪繕?biāo)物質(zhì)；此后，當(dāng)蜂蜜樣品溶液體積在6 mL時(shí)，沉積相不足5 μL，精密度較差；當(dāng)蜂蜜樣品溶液體積在7～9 mL時(shí)，沒有沉積相。當(dāng)樣品溶液體積為5 mL時(shí)，萃取基本達(dá)到平衡，回收率最高。因此，實(shí)驗(yàn)選擇樣品體積為5 mL。

圖4 樣品體積的選擇Fig.4 Selection of sample volume

2.1.6 超聲時(shí)間的影響 實(shí)驗(yàn)采用體積為5 mL的蜂蜜樣品溶液，其他條件不變，改變超聲時(shí)間（分別為0、1、2、3、5、7、10、15、20 min），考察對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，見圖5。結(jié)果表明：在前3 min，隨著超聲時(shí)間的延長，目標(biāo)物的回收率逐漸增大，在3 min后，回收率有所下降。這是因?yàn)橐环矫娉暣龠M(jìn)了兩相的混合，加快了萃取過程中的傳質(zhì)作用，從而提高了萃取效率；另一方面過長的超聲時(shí)間產(chǎn)生熱量更多，可能增加試劑的揮發(fā)程度而降低萃取效果。實(shí)驗(yàn)選擇超聲時(shí)間為3 min。

圖5 超聲時(shí)間的選擇Fig.5 Selection of ultrasonic time

2.1.7 鹽度的影響 實(shí)驗(yàn)采用乙腈∶水（1∶4，v/v）配制的0.05 μg/mL溴氰菊酯的蜂蜜樣品溶液5 mL，分別向樣品溶液中加入氯化鈉使其含量為0%、2%、4%、6%、8%、10%。再向其中分別加入20 μL氯仿，超聲3 min做微萃取實(shí)驗(yàn)，考察了鹽濃度對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果表明：隨著NaCl濃度的增加，回收率顯著降低。這是由于隨著離子強(qiáng)度的增加，有機(jī)萃取劑在水相中的溶解度減小，萃取劑在體系中未能達(dá)到均勻狀態(tài)，未能形成微小液滴，所以本實(shí)驗(yàn)選擇不加鹽。

2.1.8 pH的影響 根據(jù)溴氰菊酯的性質(zhì)，在酸性條件下能夠穩(wěn)定存在，在堿性條件下不穩(wěn)定。考慮到pH=1～2時(shí)，強(qiáng)酸對(duì)色譜柱可能存在的損害，實(shí)驗(yàn)采用乙腈∶水（1∶4，v/v）配制的0.05 μg/mL溴氰菊酯的蜂蜜樣品溶液5 mL，加入20 μL氯仿，超聲3 min做微萃取實(shí)驗(yàn)。考察pH=3～8之間目標(biāo)分析物的萃取效率，見圖6。蜂蜜空白溶液的pH為4，通過在水相中加入鹽酸或氫氧化鈉稀溶液調(diào)節(jié)待測溶液pH，實(shí)驗(yàn)得到的沉積相體積均為15 μL左右，說明pH對(duì)沉積相體積基本無影響。隨著pH的增加，回收率先增大后減小，當(dāng)pH=4時(shí)，萃取回收率最高；當(dāng)pH=8時(shí)顯著降低，這是因?yàn)橐环矫嬖谒嵝詶l件下溴氰菊酯更易于分配到有機(jī)相中，另一方面，在堿性條件下溴氰菊酯極易分解。因此選擇pH=4為最佳條件，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)不用調(diào)節(jié)pH。

圖6 pH的選擇Fig.6 Selection of pH

2.2 富集倍數(shù)、線性范圍和檢出限

富集倍數(shù)的計(jì)算方法為：有機(jī)相濃度的計(jì)算，用氯仿作溶劑配制溴氰菊酯的濃度分別為1、10、20、40、60、80、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，以峰面積對(duì)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測得的樣品峰面積求得其有機(jī)相濃度。富集倍數(shù)為萃取后有機(jī)相濃度和水溶液中初始濃度之比。在實(shí)驗(yàn)條件下，蜂蜜樣品中溴氰菊酯濃度為0.5 mg/kg時(shí)，富集倍數(shù)為600倍。

按1.2.4配制標(biāo)準(zhǔn)系列，每個(gè)濃度重復(fù)測定3次，以平均峰面積值Y對(duì)待測物質(zhì)量濃度x做線性回歸。在10～1000 μg/kg范圍內(nèi)線性良好，線性方程為：Y= 854741x+4076，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。檢出限（LOD，以信噪比S/N=3計(jì)）為8 μg/kg，定量限（LOQ，以信噪比S/N=10計(jì)）為40 μg/kg，可滿足實(shí)際樣品測定的需要。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

選用空白蜂蜜樣品，進(jìn)行不同添加濃度的萃取、測定。溴氰菊酯添加量分別為10、50、100 μg/kg，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，計(jì)算方法的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。平均加標(biāo)回收率為82.6%～97.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～3.8%，方法的準(zhǔn)確度和精密度令人滿意。蜂蜜空白色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)添加色譜圖見圖7。

表1 蜂蜜中溴氰菊酯的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table1 Recoveries and relative standard deviations of deltamethrin in honey samples（n=5）

圖7 蜂蜜空白樣品（A）和蜂蜜樣品加標(biāo)100 μg/kg（B）的色譜圖Fig.7 Chromatograms of honey blank（A）and spiked（100 μg/kg）honey sample（B）

2.4 樣品分析

應(yīng)用本方法對(duì)市售11種，33個(gè)蜂蜜樣品進(jìn)行分析測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中有3種蜂蜜樣品中檢出了溴氰菊酯農(nóng)藥，分別為：枸杞蜜含溴氰菊酯10.6 μg/kg、柑橘蜜含溴氰菊酯10.8 μg/kg，棗花蜜含溴氰菊酯20.5 μg/kg，樣品色譜圖見圖8。從樣品測定結(jié)果可以看出，蜂蜜中確實(shí)含有痕量的溴氰菊酯殘留，這一方面說明溴氰菊酯的化學(xué)穩(wěn)定性很強(qiáng)，不易降解，容易從一個(gè)環(huán)境（土壤、植物、空氣）被蜜蜂轉(zhuǎn)移到蜂蜜中；另一方面則是由于近年來溴氰菊酯作為殺蟲劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，直接或間接造成大量蜜源被污染。

目前，關(guān)于蜂蜜中溴氰菊酯的測定報(bào)道僅有兩篇［16-17］，它們的前處理方法都經(jīng)過了加鹽、液液萃取、過柱凈化和濃縮等步驟，一個(gè)樣品前處理至少需要2 h，其中每處理一個(gè)樣品需要有機(jī)溶劑40 mL。而本文采用超聲輔助分散液相微萃取技術(shù)僅需超聲和微萃取兩步，全程下來不超過10 min，且每處理一個(gè)樣品需有機(jī)溶劑不到1.5 mL。由此可以看出，本方法具有效率高、測試成本低以及有機(jī)溶劑消耗量少等明顯優(yōu)勢，開辟了對(duì)復(fù)雜基質(zhì)如蜂蜜中溴氰菊酯含量測定的新方法。

3 結(jié)論

本文建立了將超聲輔助分散液液微萃取作為前處理技術(shù)結(jié)合高效液相色譜法測定蜂蜜中溴氰菊酯農(nóng)藥殘留量的分析方法。該分析方法用于復(fù)雜基質(zhì)-蜂蜜中溴氰菊酯含量的測定，富集倍數(shù)高達(dá)600倍，在10～1000 μg/kg范圍內(nèi)線性良好，檢出限為8 μg/kg，加標(biāo)回收率為82.6%～97.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～3.8%。本方法具有操作簡便、效率高、成本低，環(huán)保等突出優(yōu)點(diǎn)，完全能夠滿足蜂蜜中痕量溴氰菊酯殘留的分析要求。同時(shí)，也是對(duì)樣品前處理方法的完善和深化。我國是一個(gè)蜂蜜出口大國，面對(duì)國際上對(duì)蜂蜜質(zhì)量的嚴(yán)苛要求以及消費(fèi)者的身體健康，建議有關(guān)部門盡快制定蜂蜜中溴氰菊酯殘留的最大限量標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，本方法的開發(fā)和應(yīng)用對(duì)其他菊酯類農(nóng)藥殘留限的檢測能夠提供技術(shù)支持。

圖8 蜂蜜樣品色譜圖Fig.8 Chromatograms of the honey samples

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Determination of deltamethrin residues in honey by HPLC coupled with ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction

YU Ling
（Chemical Engineering and Biotechnology College，Xingtai College，Xingtai 054001，China）

A method of HPLC combined with ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction was used for the determination of deltamethrin in honey.The honey sample was extracted with mixed solution of acetonitrile∶water（1∶4，v/v）.After the chloroform extraction，ultrasound and centrifugation，sedimentary facies were determined by HPLC.Deltamethrin of 10～1000 μg/kg ranged with good linearity.The correlation coefficient was 0.9998，and the enrichment factor was up to 600.When the spiked concentration of honey samples came to 10，50，100 μg/kg，the recovery rates measured by standard addition method ranged from 82.6%to 97.3%，with the relative standard deviation（RSD）between 2.1%and 3.8%.The detection limit of deltamethrin in honey samples was 8 μg/kg，and the limit of quantification was 40 μg/kg.This method was simple and accurate，with high efficiency of extraction and little consumption of organic solvent.It could be successfully applied to the determination of deltamethrin residues in honey.

dispersive liquid-liquid microextraction；high performance liquid chromatography；deltamethrin；honey

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0068-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.005

2015－05－26

于玲（1983-），女，碩士，講師，主要從事色譜分析方法的研究，E-mail：44427364@qq.com。