侵染冬瓜的病毒病原種類鑒定

尤　毅,　李華平,　謝大森

(1. 廣東省農業科學院蔬菜研究所,廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室, 廣州　510640;2. 華南農業大學資環學院, 廣州　510642)

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侵染冬瓜的病毒病原種類鑒定

尤毅1,2,李華平2,謝大森1*

(1. 廣東省農業科學院蔬菜研究所,廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室, 廣州510640;2. 華南農業大學資環學院, 廣州510642)

本研究在我國主要冬瓜產區采集具有典型病毒病癥狀的病葉材料105份,根據葫蘆科作物上常見的5種病毒病原的CP基因設計特異性引物,對105份待檢冬瓜材料進行RT-PCR檢測。檢測結果表明:5對特異引物可分別在105份待檢材料的95份中檢測到小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)、西瓜花葉病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、番木瓜環斑病毒(Papayaringspotvirus,PRSV)4種病毒,未檢測到南瓜花葉病毒(Squashmosaicvirus,SqMV);并且發現不同的冬瓜主產區致病的病毒種類有較大差異;同時還發現,在這些待檢樣品中4種病毒復合侵染現象較普遍,其中以PRSV與WMV組合最常見,占復合侵染現象的31.25%;未發現有4種病毒復合侵染。

冬瓜;病毒病;病原鑒定

冬瓜[Benincasahispida(Thunb.) Cogn.]屬葫蘆科冬瓜屬,是一年生攀緣性草本植物,起源于中國和印度,廣泛分布于亞洲的熱帶、亞熱帶及溫帶地區,目前以中國、東南亞和印度等地種植為主。冬瓜是一種經濟價值高的農作物,在我國冬瓜栽培已有2 000多年的歷史,年播種面積達25萬hm2。由于市場需求的增加,冬瓜的栽種面積逐年擴大,復種指數提高,導致冬瓜上的病害日益嚴重。過去人們的關注焦點主要集中在疫病、枯萎病等真菌病害,在這些方面做了大量的研究工作。近年來,冬瓜病毒病呈上升趨勢,所造成的危害已超過真菌病害,2003年以來，華南地區的冬瓜主產區冬瓜病毒病暴發成災,造成冬瓜大幅減產,嚴重的甚至絕產絕收[1]。

引發冬瓜病毒病的病毒種類各國相繼有報道。Samretwanich等[2]認為番茄卷葉病毒(Tomatoleafcurlvirus)是冬瓜病毒病的主要病原物,Chen等[3-4]報道臺灣冬瓜病毒病的病原物是番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)成員,可能是西瓜銀色斑駁病毒(Watermelonsilvermottlevirus, WSMV)的1個菌株。Tsuda等[5]分析了從5個不同寄主上分離的Tospovirus屬毒株,發現冬瓜分離物的蛋白質分子量是32 kD,S RNAs的分子量是1.21×106,與WSMV的序列同源率達97%。Okuda等[6]也證實在日本導致冬瓜產生病毒病的是WSMV。Tomassoli等[7]首次報道香石竹斑駁病毒屬(Carmovirus)成員甜瓜壞死病毒(Melonnecroticspotvirus,MNSV)是意大利冬瓜病毒病的病原物。這說明不同地區或國家引起冬瓜病毒病的病毒種類可能不一樣。

目前,我國發現的侵染葫蘆科作物的病毒中,分布最廣、危害最重的有5種,即小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)、西瓜花葉病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、番木瓜環斑病毒(Papayaringspotvirus,PRSV)和南瓜花葉病毒(Squashmosaicvirus,SqMV)[8]。由于缺乏有關冬瓜病毒病毒原種類的調查報道,本研究調查了葫蘆科作物上5種常見的病毒在冬瓜上的發生情況,以及我國各主要冬瓜產區的病毒病發病及病原分布情況,可為冬瓜病毒病抗性育種提供依據。

1　材料與方法

1.1供試材料

待檢材料:具有典型或可疑病毒病癥狀的冬瓜材料105份,分別采自我國冬瓜主產區,主要包括廣東三水(7份)、臺山(5份)、徐聞(8份)、清遠(英德8份,清新3份)、廣州(白云7份,番禺4份);江西樟樹(7份);湖南(長沙4份,瀏陽6份);陜西(西安2份,寶雞4份);重慶(4份);廣西(南寧11份,桂林5份);江蘇大豐(9份)以及海南(文昌5份,儋州6份),保存于-80℃超低溫冰箱。

陽性對照:ZYMV、WMV、SqMV毒源由中國農業科學院鄭州果樹研究所古勤生研究員惠贈,CMV和PRSV由華南農業大學植物病毒研究室提供。所有陽性對照均采用摩擦接種的方法接種到西葫蘆(CucurbitapepoL.)葉片上,待顯癥后采用DAS-ELISA法進行檢測,確認病原為唯一病毒病原后,取葉片干燥保存。

1.2方法

1.2.1冬瓜葉片總RNA的提取

使用天根公司RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)提取待測樣品和陽性對照的葉片總RNA,具體提取步驟參照產品說明書。

(1)勻漿處理:取50～100 mg冬瓜葉片,在液氮中迅速研磨成粉末狀,加入450 μL 裂解液RL(使用前加入β-巰基乙醇,終濃度為2%),混勻后室溫放置5 min。

(2)13 400 g 離心5 min,取上清(約400 μL)于另一新離心管。

(3)緩慢加入上清0.5倍體積的無水乙醇,混勻(此時可能會出現沉淀),將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR3中,13 400 g 離心60 s,棄掉收集管中的廢液,并將吸附柱CR3放回收集管中。

(4)向吸附柱CR3中加入700 μL去蛋白液RW1,13 400 g離心60 s,棄掉收集管中的廢液,將吸附柱CR3放回收集管中。

(5)向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW(使用前已按比例加入無水乙醇),室溫靜置2 min,13 400 g離心60 s,棄掉收集管中的廢液,并將吸附柱CR3放回收集管中。

(6)重復步驟(5)。

(7)13 400 g空柱離心2 min,取出后將吸附柱CR3置于室溫放置數分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

(8)將吸附柱CR3放入一個新的RNase-free離心管中,向吸附膜中間部位懸空滴加50 μL RNAse-free ddH2O,室溫靜置2 min,13 400 g離心2 min,得到RNA溶液。

RNA溶液保存于-80℃冰箱。

1.2.2冬瓜病毒病毒原RT-PCR檢測

1.2.2.1引物設計

根據文獻報道及已有的病毒CP基因序列,設計引物組合(表1)。

1.2.2.2RT-PCR擴增

采用寶生物工程(大連)有限公司Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)進行反轉錄,常規PCR擴增。反轉錄體系及PCR擴增體系參考產品說明書,5種病毒的PCR擴增參數見表2。PCR產物4℃保存,取8 μL在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳,PCR檢測呈陰性的待檢材料,重復1次RT-PCR擴增,若結果仍為陰性,則重新提取RNA,再次進行RT-PCR擴增,若檢測結果仍為陰性,即認為該材料不含有病毒。

表1　檢測5種病毒毒原CP基因的特異性引物Table 1　Specific primers for detection of CP gene in the five virus pathogens by RT-PCR

表2　5種病毒的PCR擴增參數1)Table 2　PCR amplification parameter for each virus

1) 循環次數均為35次。∞代表反應時間不限定,直到樣品取出為止。

35 cycles. ∞ indicated reaction time was unlimited till the samples were taken out.

2　結果與分析

2.1RT-PCR擴增結果

在西葫蘆上分別接種5種病毒,取有明顯癥狀的葉片作為陽性對照。以待測樣品及陽性對照的總RNA作為模板,分別用不同的引物對進行RT-PCR擴增。部分檢測結果見圖1,陽性對照和待檢樣品中,引物ZYMV-F/ZYMV-R可擴增出大小約1 500 bp的條帶(圖1a);引物WMV-F/WMV-R可擴增出大小約為1 200 bp的條帶(圖1b);引物CMV-F/CMV-R可擴增出大小約660 bp的條帶(圖1c),引物PRSV-F/PRSV-R可擴增出大小約500 bp的條帶(圖1d);引物SqMV-F/SqMV-R僅在陽性對照中能擴增出大小約1 100 bp的條帶(圖1e),在所有的待檢材料中均沒擴出目標條帶。3次重復檢測結果一致。這表明在待檢樣品中能分別檢測出CMV、ZYMV、PRSV和WMV,但未檢測到SqMV。

2.2各地區的發病情況統計

不同地區的待檢材料RT-PCR檢測結果見表3。105份材料中有95份分別檢出ZYMV、CMV、PRSV和WMV 4種病毒,未檢測出SqMV,陽性檢出率達90.48%。其中陽性檢出率最高為PRSV和WMV(檢出率分別達47.62%和45.72%),其次為ZYMV和CMV(檢出率分別達24.76%和21.90%)。按待檢材料的采集區域來看,廣東大部分區域(除廣州白云、徐聞外)及海南所采的樣品中,未檢出ZYMV;在廣東清新、徐聞、海南、江西、江蘇及湖南地區采集的樣品中,未檢出CMV;在廣東番禺、清新、陜西西安和寶雞采集的樣品中未檢出WMV;在各地區的樣品中均能檢出PRSV;在所有的樣品中,均未檢出SqMV。這些結果表明,PRSV與WMV在我國主要冬瓜產區可能分布最為廣泛,其次是ZYMV與CMV,在冬瓜上尚未發現SqMV。

表3的結果反映出在各地區普遍存在不同病毒的復合侵染現象。其中有2種病毒復合侵染,也有3種病毒復合侵染,但未見4種病毒復合侵染。且病毒組合多種多樣,有ZYMV與CMV組合,ZYMV與PRSV組合,ZYMV與WMV組合,PRSV與WMV組合,PRSV與CMV組合,WMV與CMV組合,ZYMV、WMV與PRSV組合,ZYMV、WMV與CMV組合,ZYMV、PRSV與CMV組合。2種病毒復合侵染,以PRSV與WMV組合最常見,在95份檢出樣品中有15份材料,占復合侵染組合的31.25%;3種病毒復合侵染則相對較少,共5份材料,其中有3份是ZYMV、WMV和PRSV組合。

采集地Site樣品總數/份Totalnumberofsamples攜帶不同病毒樣本數/份NumberofsampleswithdifferentvirusesZYMVCMVPRSVWMVSqMV復合侵染Mixedinfection份數Number百分率/%Percentage陽性檢出率Positiverate份數Number百分率/%Percentage白云Baiyun733240455.56685.71番禺Panyu40120000375.00清新Qingxin30010000133.33英德Yingde80266081008100三水Sanshui703250342.867100臺山Taishan501130120.00480.00徐聞Xuwen820550562.50787.50江蘇Jiangsu960540666.679100江西Jiangxi720240228.577100陜西Shaanxi616400583.336100海南Hainan1100620218.18981.82湖南Hunan1030460220.0010100廣西Guangxi1676870743.751487.50重慶Chongqing421220375.004100合計Total1052623504804845.719590.48

各地區樣品的病毒檢出率都較高,廣東三水和英德、陜西、江西、江蘇、湖南及重慶地區的檢出率達到100%,清新地區檢出率最低。由于本研究所采集的冬瓜樣品均為具有典型病毒病癥狀的冬瓜葉片,但部分樣品未檢出上述5種病毒中的任意一種,說明除了這5種病毒外,可能還存在其他種類的病毒危害冬瓜生產。

3　討論

從本研究的結果來看,侵染冬瓜的病毒病原主要有ZYMV、CMV、PRSV和WMV 4種,未檢測出SqMV陽性的材料。利用機械摩擦人工接種冬瓜葉片,SqMV可以成功接種,并在冬瓜葉片上產生典型的病毒病病斑[9],本研究在所有供試冬瓜材料中未檢出SqMV的主要原因有:(1)病毒毒原的分布具有地區性,在我國,報道該病毒發生的地方并不多,目前只在黑龍江的南瓜(Cucurbitamoschata)[10],新疆[11-13]、甘肅[12]的甜瓜(Cucumismelo),山西運城的南瓜[14]、河南開封和孟津的西葫蘆(Cucurbitapepo)[14]上發現。(2)樣品采樣的主要依據是冬瓜葉片上有無病斑,由于病毒侵染具有潛伏期,在潛伏期內植株不表現癥狀,導致漏采。(3)采樣量少,一方面的原因是采樣地點具有病毒病癥狀的植株少;有的病株已經枯萎,失去研究的可能性;另一方面,采樣地點發病植株表現的癥狀非常相似,具有差異的病株較少,導致重復采樣。

本研究中,尚有部分材料具有典型病毒病癥狀,但對5種所檢病毒均呈陰性的材料,未檢出病毒的原因主要有:(1)保存時間過長且保存條件不好,導致RNA降解。(2)材料受到除本文涉及的5種病毒以外的其他病毒侵染,據目前的報道,冬瓜上的病毒病原除了本研究所涉及的5種外,已經確認的還有黃瓜綠斑駁花葉病毒、西瓜銀色斑駁病毒[4]、番茄曲葉病毒[2]、馬蹄蓮褪綠斑病毒[15]等,其中有部分為檢疫病毒,但如黃瓜綠斑駁花葉病毒在我國已有相關報道,不排除該病毒侵染冬瓜的可能性。

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(責任編輯：楊明麗)

Identification of pathogenic viruses infecting wax gourd

You Yi1,2,Li Huaping2,Xie Dasen1

(1. Vegetable Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangdong Provincial Key Lab for New Technology Research on Vegetables, Guangzhou510640, China; 2. College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou510642, China)

According to the CP genes ofZucchiniyellowmosaicvirus(ZYMV),Watermelonmosaicvirus(WMV),Cucumbermosaicvirus(CMV),Papayaringspotvirus(PRSV)andSquashmosaicvirus,(SqMV), five pairs of specific primers were designed for RT-PCR. A total of 105 diseased wax gourd leaf samples with typical symptoms collected from the main producing area were amplified with the specific primers. ZYMV, WMV, CMV and PRSV were detected in the 95 diseased samples, and all the tested samples showed negative with SqMV. There were different types of pathogenic viruses in different main producing areas.Complex infection is very common, and 31.25% of them is mixed infection of PRSV and WMV, which is the most common one. No infection was found by all four viruses.

wax gourd;virus disease;pathogen identification

2015-02-14

2015-04-17

廣州市產學研協同創新重大專項(201508020085);廣東省公益研究與能力建設專項資金項目(20140202)

E-mail: xiedasen@126.com

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.033