實時熒光PCR檢測瓜炭疽病菌

王　翀,　張小菊,　張祥林,　張　偉,張　瑜,　李亞偉,　孫燕飛

(1. 新疆出入境檢驗檢疫局,烏魯木齊　830063; 2. 石河子大學,石河子　832000)

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實時熒光PCR檢測瓜炭疽病菌

王翀1,張小菊1,張祥林1,張偉1,張瑜1,李亞偉1,孫燕飛2*

(1. 新疆出入境檢驗檢疫局,烏魯木齊830063; 2. 石河子大學,石河子832000)

采用實時熒光PCR技術建立了瓜炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)的檢測方法。根據瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因序列,設計了該病菌特異性引物和TaqMan探針,并對所設計的引物和探針的反應條件進行了優化。采用本試驗建立的實時熒光PCR方法對瓜上的其他菌株及近似菌株進行檢測,可將瓜炭疽病菌與其他病原菌區分開。靈敏度試驗表明,25 μL體系中只要有39.6 pg的核酸量就可以被檢測到,檢測靈敏度達到1.584 pg/μL,比普通PCR檢測靈敏度高100倍。同時對田間采集的病株和未知樣品進行的檢測證明了引物和TaqMan探針的特異性。

實時熒光PCR;檢測;瓜炭疽病菌

瓜炭疽病是瓜類作物上的重要病害,其病原菌為Colletotrichumorbiculare。該病危害嚴重,在貯運期間可通過染病瓜繼續蔓延,造成西瓜和甜瓜采后腐爛變質,產量和品質下降[1-2]。據報道,1978-1992年新疆塔城地區一般年份瓜炭疽病發病率都在20%以上,嚴重年份達100%,損失慘重。1990年在塔城地區的打瓜田因該病導致植株全部死亡,一無所收[3]。建立對瓜炭疽病菌的快速檢測技術對于瓜炭疽病的早期防治具有非常重要的意義。國內外對瓜炭疽病菌的研究,主要集中在危害癥狀、病原菌生物學特性及生物防治方面,檢驗方法主要是常規種子帶菌檢驗。唐建輝等根據Colletotrichum屬24個種的ITS序列,利用RAPD和SCAR標記,設計篩選出2對引物組成雙重PCR,能特異性鑒定出C.orbiculare[4]。目前國內未見報道有關檢測該病菌的實時熒光PCR特異性引物和探針。本文依據瓜炭疽病菌GAPDH基因和GS基因序列,設計了2對特異性引物和2條TaqMan探針,建立了瓜炭疽病菌的實時熒光PCR檢測方法,旨在實現瓜炭疽病菌的快速分子檢測。

1　材料與方法

1.1供試材料

表1所列的供試菌株用于本試驗設計引物及探針的特異性檢測,表2所列的西瓜病果、病葉、西甜瓜出口用種子及實驗室自制帶菌種子為本研究建立的熒光PCR體系的待檢樣品。

帶菌種子制備:取50 g干凈的西瓜種子放入三角瓶中,經高壓滅菌后,將PDA培養的瓜炭疽病菌菌塊放到瓶中,加入100 mL PDB,置于25 ℃培養箱中振蕩培養5～6 d,將該種子和另一份滅菌的西瓜種子按照1∶5的比例混合制成帶菌種子樣品。

1.2主要儀器及試劑

主要儀器包括:Hitachi高速離心機,ND1000核酸檢測儀,TY-C型多功能電泳儀,通用凝膠成像系統(Intas Gel Jet Imager),Eppendorf多重控溫熒光PCR儀,7300 Real-Time PCR System (美國ABI公司)。所用PCR試劑購于大連寶生物公司、核酸提取試劑盒等均購于天根生化科技(北京)有限公司;引物和探針均由鼎國生物工程公司合成。

1.3病原菌培養和處理

供試菌株在PDA培養基上25 ℃培養2～3 d,取菌落邊緣處菌絲接到PDB中振蕩培養3～4 d,收集菌絲,用Miracloth膜過濾,用無菌水洗滌后待水分揮發干,用液氮研磨成粉狀,待用。

1.4DNA提取

利用北京天根生化科技有限公司新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03)提取病菌總DNA和植株、種子基因組DNA。

1.5TaqMan引物和探針設計

從GenBank查詢所有瓜炭疽病菌的相關序列,經過大量的網上BLAST比對和聚類分析,發現無法僅僅通過一個基因把瓜炭疽病菌和其他近似病原菌區別開,但是通過GAPDH和GS基因聯合檢測,能夠把瓜炭疽病菌與其他炭疽菌近似菌株及瓜上其他病原菌完全區別開,所以本研究針對這2個功能基因設計2對引物和2條探針進行檢測。

1.6實時熒光PCR及反應體系參數的優化

使用編號ATCC14724的瓜炭疽病菌菌株DNA對擴增GAPDH和GS基因的關鍵性參數退火溫度和Mg2+濃度進行優化。

退火溫度優化采用25 μL反應體系:10×buffer 2.5 μL,25 mmol/L Mg2+2 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL,5 U/μLTaqMan聚合酶0.2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,TaqMan探針(10 μmol/L) 0.5 μL,模板DNA 0.5～2 μL,用滅菌水補足至25 μL。反應程序為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,設定退火溫度(55.2, 55.4, 56, 56.8, 57.9, 59.1, 60.4, 61.4, 62.6, 63.5, 64, 64.1 ℃)下1 min,40個循環。退火溫度的優化在Eppendorf熒光PCR儀上完成。

在確定最佳退火溫度后進行Mg2+濃度優化,濃度優化采用7300 Real-Time PCR System,Mg2+濃度設置為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mmol/L,共8個不同濃度處理。反應體系中其他成分用量同退火溫度優化體系。

1.7靈敏度檢測

以編號ATCC14724的瓜炭疽病菌菌株DNA為模板,確定該方法所能檢測的最低核酸量,起始DNA濃度為19.8 ng/μL,按10倍梯度依次稀釋為:1.98 ng/μL、198 pg/μL、19.8 pg/μL、1.98 pg/μL、198 fg/μL、19.8 fg/μL、1.98 fg/μL,加樣量均為2 μL,對應的核酸量為:39.6 ng、3.96 ng、396 pg、39.6 pg、3.96 pg、396 fg、39.6 fg、3.96 fg,采用實時熒光PCR進行檢測,同時將熒光PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8引物和探針特異性檢測

采用優化的反應體系，以表1所列的供試菌株DNA為模板進行實時熒光PCR檢測,驗證所設計的擴增GAPDH和GS基因引物和探針的特異性。

1.9實時熒光PCR應用于樣品檢測

采用本研究建立的實時熒光PCR方法對田間采集的瓜炭疽病菌病果、病葉、西甜瓜出口用種子及自制帶菌種子樣品(表2)進行檢測。發病組織、種子樣品經液氮研磨后用試劑盒提取基因組DNA,采用建立的實時熒光PCR體系檢測。

2　結果與分析

2.1引物與探針

根據GenBank中瓜炭疽病菌的GAPDH基因和GS基因相關序列,設計得到擴增瓜炭疽病GAPDH基因和GS基因的特異性引物和TaqMan探針。GAPDH-3:5′-CCCTTCATTGAGACCAAGT-3′;GAPDH-4:5′-GTACTTGAGCATGTAGGCCT-3′;GAPDH-p:5′-CCGGGATCTCTGGCATTACG-3′,產物大小234 bp。GS-3:5′-TTCGTTCTCGAACACGAT-3′;GS-4:5′-GAGACATGACGACCTTGTTC-3′;GS-p: 5′-TGCACGTCTGGTCCAGTTCTGT-3′,產物大小209 bp。

表1　供試菌株的病原名稱、寄主和來源Table 1　Names, hosts and sources of the strains used in the study

表2　供試樣品及來源Table 2　Tested sample used in the study

2.2實時熒光PCR條件優化

對PCR中的關鍵性條件Tm值和Mg2+濃度進行優化,確定獲得最大ΔRn值和最小循環閾值(Ct)的Tm值和Mg2+濃度。

結果表明,在建立的實時熒光PCR反應體系中,擴增GAPDH基因的最佳退火溫度為57.9 ℃;Mg2+濃度為3.5 mmol/L;擴增GS基因的最佳退火溫度為56 ℃;Mg2+濃度為3 mmol/L。

2.3檢測靈敏度

以不同濃度的瓜炭疽病菌菌株DNA為模板,按照優化后的體系進行實時熒光PCR檢測,結果表明病菌DNA濃度越大Ct值越小,25 μL體系中有39.6 pg(10-3)的核酸量,雖然信號非常弱,但依然可以被檢測到(圖1～4),說明實時熒光PCR方法所能夠檢測的最低DNA濃度為1.584 pg/μL。實時熒光PCR方法的產物采用瓊脂糖凝膠進行檢測,在10-1稀釋倍數下還可以看到條帶,但是10-2已無可識別條帶(圖5～6)。說明實時熒光PCR方法較常規PCR后電泳方法的檢測靈敏度高100倍。

2.4引物和探針特異性檢測

采用實時熒光PCR方法對表1中所列的14個供試菌株進行檢測,結果表明,瓜炭疽病菌的8個菌株都檢測到熒光,Ct值均小于30,采用GAPDH基因檢測時,Colletotrichumlindemuthianum沒有熒光信號,但是采用GS基因檢測時，除8個瓜炭疽病菌菌株外，C.lindemuthianum也出現強陽性信號,瓜上的其他病原菌和其他菌株均不產生熒光,因此設計的2對引物和探針共同檢測才能有效地將瓜炭疽病菌與其他病原菌區分開來(圖7～8),說明上述引物和TaqMan探針有很強的特異性。

圖1　不同DNA濃度對GAPDH基因檢測體系的影響Fig.1　Influences of different DNA concentrations on GAPDH gene detection system

圖2　GAPDH基因不同模板濃度下的Ct值Fig.2　Ct values at different DNA concentrations for GAPDH gene

2.5樣品檢測

使用本試驗設計的2對引物和探針對田間采集的具有瓜炭疽病癥狀的西瓜病果、病葉、實驗室自制西瓜帶菌種子、4批出口用西甜瓜種子進行檢測,結果表明,田間采集樣品、實驗室自制帶菌種子中檢測到瓜炭疽病菌(圖9a～b),供試的4批西甜瓜種子中沒有檢測到熒光信號,常規分離培養的方法也沒有分離到病原菌,證明這4批種子中不含有瓜炭疽病菌,兩種方法的檢測結果一致。

圖4　GS基因不同模板濃度下的Ct值Fig.4　Ct values at different DNA concentrations for GS gene

圖5　GAPDH基因實時熒光PCR產物電泳檢測結果Fig.5　Agarose gel electrophoresis of real-time PCR-amplified products of GAPDH gene

3　討論

GenBank中報道的瓜炭疽病菌序列很多,有ITS、β-tubulin (TUB2)、chitin synthase 1 gene(CHS1)、

histone H3 gene (HIS3)、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (GAPDH)、actin gene (ACT)、glutamine synthase gene (GS)等,為設計特異性引物和探針提供了充足的信息。但是經過大量的網上BLAST比對,從已經公布的瓜炭疽病菌的序列中很難找到突變位點設計探針,最終找到GAPDH基因和GS基因,但是僅僅單獨檢測GAPDH基因或GS基因不能確定病原菌為瓜炭疽病菌,必須對GAPDH基因和GS基因一起檢測,才能夠把瓜炭疽病菌與其他近似病原菌完全區別開來,所以本研究針對這兩個功能基因設計兩對引物和兩條探針進行檢測。

圖6　GS基因實時熒光PCR產物電泳檢測結果Fig.6　Agarose gel electrophoresis of quantitative real-time PCR-amplified products of GS gene

圖7　基于GAPDH基因的病原菌實時熒光PCR檢測Fig.7　Detection of different pathogen strains using quantitative real-time PCR based on GAPDH gene

圖8　基于GS基因的病原菌實時熒光PCR檢測Fig.8　Detection of different pathogen strains using quantitative real-time PCR based on GS gene

圖9　基于GAPDH和GS基因的感病樣品實時熒光PCR檢測Fig.9　Detection of sample infected by Colletotrichum orbiculare using quantitative real-time PCR based on GAPDH and GS gene

本研究選擇瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因序列設計引物和探針,通過對侵染瓜類作物的瓜炭疽病菌和其他5種病原菌的檢測研究,表明該方法具有良好的特異性、穩定性和靈敏性。本研究首次對瓜炭疽病菌進行了較為系統、深入的分子檢測技術的研究；建立了快速、準確、靈敏的瓜炭疽病菌實時熒光PCR檢測技術；成功地設計出了針對瓜炭疽病菌，具有穩定點突變的特異性引物對GAPDH-3、GAPDH-4和TaqMan探針GAPDH-p、GS-3、GS-4和TaqMan探針GS-p,通過對熒光反應體系中的退火溫度、Mg2+兩個關鍵參數進行優化確定了最佳值,建立了實時熒光PCR檢測方法,確定GAPDH最佳退火溫度為57.9 ℃，Mg2+濃度為3.5 mmol/L。GS最佳退火溫度為56 ℃，Mg2+濃度為3 mmol/L。

利用該方法對14株供試菌株進行了實時熒光PCR檢測,結果表明本研究所設計的引物和探針能檢測出瓜炭疽病菌菌株,而其他病原菌的菌株和空白對照均未檢測到熒光信號,表明該引物和探針對瓜炭疽病菌具有很高的特異性;該對引物和探針具較高的靈敏度,能夠達到1.584 pg/μL,可見本研究建立的實時熒光PCR方法保證了不同樣品間檢測結果的可靠性和穩定性。整個PCR檢測時間大約40 min,與普通PCR相比,極大地縮短了檢測的時間,同時無需后續的電泳檢測。應用本研究建立的TaqMan探針實時熒光PCR方法對田間采集樣品和種子混菌樣品進行檢測,檢測出陽性樣品,此結果與分離檢測結果一致。

瓜炭疽病菌長距離傳播主要依靠感病的植株、病殘體以及受侵染的種子等植物性材料。目前國內未見報道有關檢測該病菌的熒光PCR特異性引物和探針。目前瓜炭疽病菌的檢驗方法主要是常規種子帶菌檢驗。這種方法經驗性較強,瓜炭疽病菌和其他近似病原菌在形態上較難區分。因此建立針對瓜炭疽病菌的快速、準確的檢測方法至關重要。

本研究中所采用的瓜炭疽病菌為菌株、田間發病樣品或人為混合樣品,因為采集的樣品種類有限,沒有進行更系統的驗證,需要在后續試驗中加以驗證。

在進行序列比對時發現，單獨檢測GAPDH基因,無法區別Colletotrichumspinosum和Colletotrichummalvarum,單獨檢測GS基因，無法區別Colletotrichummalvarum、Colletotrichumtrifolii和Colletotrichumlindemuthianum,由于收集菌株數量有限,有的菌株無法進行驗證。

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(責任編輯：楊明麗)

Detection ofColletotrichumorbiculareby the real-time PCR

Wang Chong1,Zhang Xiaoju1,Zhang Xianglin1,Zhang Wei1,Zhang Yu1,Li Yawei1,Sun Yanfei2

(1. Xinjiang Entry & Exit Inspection and Quarantine Bureau, Urumqi830063, China;2. Shihezi University, Shihezi832000, China)

The detection ofColletotrichumorbiculareby real-time PCR was established.The specific primers andTaqMan probes were designed according to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)gene and glutamine synthase(GS)gene sequences inC.orbiculare, and the reaction conditions were optimized.C.orbicularecould be detected from other strains in melon and other similar strains by real-time PCR. The sensitivity test indicated that 39.6 pg DNA could be detected in 25 μL reaction system. The real-time PCR sensitivity could reach to 1.584 pg/μL, 100 times more sensitive than ordinary PCR. The primers andTaqman probe were shown to be specific by detecting infected plants sampled in the field and unknown samples.

real-time PCR;detection;Colletotrichumorbiculare

2015-01-07

2015-04-06

國家質量監督檢驗檢疫總局科研計劃項目(2013IK287, 2011IK168); 國家科技部質檢公益性行業科研專項(201310091)

E-mail:81711308@qq.com

S 436.5

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.023

致謝：感謝新疆農業科學研究院楊渡研究員和韓盛博士為本研究提供菌株。