JAK1/TYK2- STAT-1/2信號通路對手足口病腦炎的診療價值

陳潔 溫正旺 陳曉晴 金龍騰 陳益平 李昌崇

JAK1/TYK2- STAT-1/2信號通路對手足口病腦炎的診療價值

陳潔 溫正旺 陳曉晴 金龍騰 陳益平 李昌崇

目的 探討干擾素JAK1/TYK2- STAT-1/2信號通路在EV71手足口病腦炎中的診療價值。方法 選取2014年1月至2015年1月手足口病患兒144例為觀察組，分成4組，手足口病兒童2d組（A組）、手足口病兒童5d組（B組）、手足口病腦炎2d組（C組）、手足口病腦炎5d（D組）組，另選擇正常體檢兒童為對照組，每組各36例，用ELISA法檢測患兒血液中JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2蛋白及干擾素的表達水平。結果 觀察組干擾素的表達水平明顯高于對照組（P＜0.01），B組明顯高于D組及A組（P＜0.01）；觀察組JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2蛋白的表達水平明顯高于對照組（P＜0.01），B組高于D組及A組（P＜0.01）。結論 手足口病腦炎患兒干擾素及JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2蛋白的表達水平與正常兒童比較明顯升高，但與普通手足口病患兒比較降低，提示JAK1/TYK2-STAT-1/2信號通路對手足口病腦炎具有一定的診斷意義。

EV71 手足口病 腦炎 干擾素

手足口病是一種較為嚴重的傳染性疾病，嚴重者可并發手足口病腦炎，好發于學齡前兒童，多數癥狀在未經藥物治療的情況下3～6d好轉［1］。研究認為EV71導致手足口病腦炎＞50%［2］。干擾素可以影響EV71手足口病腦炎的進展及預后，其在體內主要包括產生和應答機制，本文探討干擾素JAK1/TYK2-STAT-1/2信號通路對EV71手足口病腦炎的影響，為手足口病腦炎診療及研究提供一個新的靶點。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2015年1月本院手足口病患兒144例為觀察組，男72例，女72例，年齡6個月至3歲。均經腦脊液、糞便EV71檢查及臨床表現確診，排除合并其它疾病。依據病情及時間分成4組，手足口病患兒2d組（A組）、5d組（B組）；手足口病腦炎患兒2d組（C組）、5d組（D組），每組各36例。另選擇同期健康體檢兒童36例為對照組，男18例，女18例；年齡6個月至3歲。各組一般資料比較差異無統計學意義。

1.2 方法 采用ELISA法檢測各組中JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2及干擾素的蛋白表達（試劑盒由博士得公司提供），每日清晨抽取各組的外周靜脈血1.5 ml，共5組，加入 24孔培養板中，每孔加入40μl血，第1 孔加入生理鹽水作為基礎對照，第2、3、4、5、6 孔作陽性對照，加入植物血凝素（PHA）100μl，后5孔分別用生理鹽水稀釋成 50g/ml，加入總量均為200μl，加入抗原后輕微搖動20s，37 ℃水浴中孵育時16～20h，抽取血漿上清液適量，于-20 ℃冰箱冷凍備用，根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。干擾素的釋放水平檢測嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統計學分析 采用SPSS12.0統計軟件。正態計量資料以（±s）表示，正態分布資料采用one-way ANOVA方差分析，組間比較方差齊采用LSD檢驗，方差不齊則采用Tamhane's T2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

觀察組干擾素的表達水平明顯高于對照組（P＜0.01），B組明顯高于D組及A組（P＜0.01）；觀察組JAK1、TYK2、STAT-1、STAT-2蛋白的表達水平明顯高于對照組（P＜0.01），B組高于D組及A組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組相關指標比較（±s）

表1 各組相關指標比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與A組比較，#P＜0.01；與D組比較，△P＜0.01

組別JAK1TYK2STAT1STAT2干擾素A 組1.98±0.07*3.47±0.09*2.47±0.08*2.01±0.07*2.76±0.07* B組3.93±0.13*#△4.75±0.11*#△3.64±0.11*#△3.41±0.13*#△3.78±0.011*#△C組1.85±0.08*3.35±0.13*2.39±0.07*1.96±0.07*2.60±0.07* D組2.25±0.15*3.77±0.17*2.53±0.14*2.11±0.10*2.77±0.012*對照組1.20±0.092.23±0.061.58±0.091.38±0.061.55±0.04 F值267.16122.94115.61312.14133.05 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

3 討論

手足口病是一種嚴重的傳染性疾病，多發生于＜5歲兒童，患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜炎等并發癥。個別重癥患兒病情發展快，導致死亡。目前仍缺乏有效治療藥物，主要對癥治療。手足口病腦炎的病理生理機制目前尚未完全明確，據流行病學調查，EV71病毒是致手足口病腦炎最常見的一種病毒，絕大多數的手足口病腦炎多由EV71病毒感染引起，但目前對EV71病毒的檢測及EV71病毒感染的治療存在滯后性及缺乏針對性，目前研究發現EV71病毒感染所致手足口病腦炎可導致腦干腦炎以及嚴重的神經系統損傷。

干擾素作為一種應用廣泛的抗病毒藥物，在EV71腦炎的治療中引起關注。干擾素是一類高活性多功能的糖蛋白，能誘導細胞對病毒感染產生抗性，其通過干擾病毒基因轉錄或病毒蛋白組分的翻譯，從而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗腫瘤生物制品［3］。其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒，作為廣譜病毒抑制劑，對RNA和DNA病毒均有抑制作用。崔雨［4］研究認為，當機體感染病毒時會分泌干擾素產生抗病毒作用，當感染EV71病毒時，則會抑制干擾素的分泌。 在臨床治療中使用干擾素制劑可以對EV71手足口病腦炎的癥狀起到控制作用［5］。本資料中EV71手足口病腦炎患兒的干擾素水平明顯高于正常兒童，提示干擾素與EV71手足口病腦炎存在重要聯系。

干擾素主要通過其應答信號通路發揮作用。干擾素的應答通路，通常指經典的Janus激酶-信號轉導子與轉錄激活子（JAK-STAT）信號通路，在抗病毒方面具有重要作用。在這條通路中JAK和STAT蛋白的表達最為重要。大多數白介素（ILs）、細胞集落刺激因子（CSFs）和干擾素（IFNs）等細胞因子均通過JAK/STAT信號通路發揮作用，提示JAK/STAT信號通路參與細胞內多種生物學活動。有研究提示干擾素的應答通路中，主要有JAK1、TYK2、STATI和STAT2參與。

酪氨酸激酶2（TYK2）是JAK（Januskinase）信號傳導家族的成員之一，IL-12和IFN信號途徑均需要的一種酶，是IFN、IL-6、IL-10、lL-12和IL-13信號傳導的重要分子；TYK2功能缺失會導致多種細胞因子信號通路發生缺陷。TYK2在免疫系統的抗病毒及腫瘤監測中具有關鍵作用，與多種細胞因子受體鏈相聯，包括干擾素受體，白細胞介素受體。目前已成功建立TYK2基因調控位點大鼠模型，證實TYK2在大鼠模型中具有抗病毒作用。在TYK2基因敲除（TYk2-）小鼠模型中，機體的免疫系統產生損傷作用，例如T淋巴細胞和樹突狀細胞會出現失功能狀態，引起的NK細胞和CD4+T細胞的反應缺乏，對淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒導致的CD8+CTL反應減弱，碩大利什曼原蟲感染后，IL-12引起的CD8+T細胞IFN的產生出現強烈抑制，急性細胞內感染的李斯特菌CD8+Tcl的IFN產生明顯減少，提示TYk2在IL-12通過其受體激活NK細胞、CIM+T細胞和CD8+T細胞的信號傳導中起重要作用［6］。本資料中發現手足口病及并發腦炎患兒，TYK2隨著發病時間出現不同程度的升高，這些均與干擾素的產生及功能表達相關，提示TYK2在干擾素的信號系統中具有重要作用。

干擾素首先與細胞膜上的受體IFNARl和IFNAR2結合，隨后激活與之偶聯的Janus激酶家族的Jakl和TYk2，Jakl和TYk2的磷酸化使得下游的信號轉導與轉錄激活因子1和2（STAT1，STAT2）發生磷酸化而活化，磷酸化的STATl和STAT2與干擾素反應因子9（IRF9）形成轉錄因子復合物干擾素刺激基因因子3 （ISGF3）［7］。ISGF3轉位到核內與干擾素刺激調節基元（ISRE）結合引發下游抗病毒蛋白的轉錄和翻譯，從而發揮干擾素的抗病毒作用［8］。

JAT/stat信號通路在抗病毒中的作用極為常見，其在抗病毒免疫系統中具有重要作用，在多個干擾素相關的抗病毒過程中均檢測到通路信號分子蛋白表達的改變。研究提示在兒童最常見的呼吸道合胞病毒感染中，呼吸道合胞病毒會抑制干擾素介導的抗病毒反應，最常見的是抑制STAT1和STAT2的蛋白表達，最終導致ISGF3和IRF9表達的下降［9］。在丙肝患者的免疫細胞中，STAT蛋白的表達出現明顯下降，與肝臟細胞中HCV的表達正好相反，然而STAT mRNA的表達卻呈正常值，未出現波動，機制分析揭示，當HCV感染時，STAT蛋白優先出現泛素化，其降解過程卻會被蛋白酶體相關的抑制物MG132阻止，這些提示HCV感染涉及的干擾素信號通路激活過程中，JAK/STAT通路作用較為明顯［10］；本資料顯示在EV71手足口病及并發腦炎的患兒中JAK/STAT通路的表達水平明顯升高，存在時間依賴性，值得注意的是在手足口病腦炎患兒中，該通路的表達水平并未隨發病時間的延長而升高，提示EV71病毒感染對該通路具有抑制作用，與以往的研究一致，提示JAK/STAT通路參與EV71手足口病腦炎的發生發展過程。

據此作者推測干擾素JAK1/TYK2-STAT-1/2信號通路可能在EV71中樞神經系統損傷中發揮重要作用且具有一定的診療意義。但本課題由于其局限性，未設置通路抑制劑組進行比較，無法全面了解該信號通路在手足口病腦炎中的作用，后續將通過動物實驗來進一步驗證。

1 Lin Y L， Yu C I， Hu Y C， et al. Enterovirus type 71 neutralizing antibodies in the serum of macaque monkeys immunized with EV71 virus-like particles. Vaccine，2012，30（7）：1305～1312.

2 李潔， 曲梅， 賈蕾， 北京市2010年手足口重癥病例EV71檢出情況及病原學分析.中華流行病學雜志，2012，33（9）：926～929.

3 Huang T S， Shyu Y C， Chen H Y， et al. A systematic review and meta-analysis of adjuvant interferon therapy after curative treatment for patients with viral hepatitis-related hepatocellular carcinoma. J Viral Hepat，2013，20（10）：729～743.

4 崔雨，宋佳， 腸道病毒71型抵抗Ⅰ型干擾素誘導的抗病毒作用. 中華實驗和臨床病毒學雜志，2012，26（2）：102～104.

5 陳聰，余春梅，王曉宇.重組人干擾素α1b霧化治療121例手足口病療效分析. 檢驗醫學與臨床，2014（09）：1233～1234.

6 Vielnascher R M， Hainzl E， Leitner N R， et al. Conditional ablation of TYK2 in immunity to viral infection and tumor surveillance. Transgenic Res，2014，23（3）：519～529.

7 Nadeau O W， Domanski P， Usacheva A， et al. The proximal tyrosines of the cytoplasmic domain of the beta chain of the type I interferon receptor are essential for signal transducer and activator of transcription （Stat） 2 activation. Evidence that two Stat2 sites are required to reach a threshold of interferon alpha-induced Stat2 tyrosine phosphorylation that allows normal formation of interferon-stimulated gene factor 3. J Biol Chem，1999，274（7）：4045～4052.

8 Zhao H， Boije H， Granberg F， et al. Activation of the interferoninduced STAT pathway during an adenovirus type 12 infection. Virology，2009，392（2）：186～195.

9 Wang R， Nan Y， Yu Y， et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Nsp1beta inhibits interferon-activated JAK/STAT signal transduction by inducing karyopherin-alpha1 degradation. J Virol，2013，87（9）：5219～5228.

10 Stevenson N J， Bourke N M， Ryan E J， et al. Hepatitis C virus targets the interferon-alpha JAK/STAT pathway by promoting proteasomal degradation in immune cells and hepatocytes. FEBS Lett，2013，587（10）：1571～1578.

Objective To investigate the role of JAK1/TYK2-STAT-1/2 signal pathway in the diagnosis of EV71-induced encephalitis of hand food and mouth disease. Methods The study was conducted at second Affi liated Hospital and Yuying Children Hospital of Wenzhou Medical College from January 2014 to January 2015，based on blood examination，CSF routine test and clinical manifestation. There were 180 members and they divided into fi ve groups，each group includes 36. 2 day control group（2C），2 day hand-food-mouth（2h），5 day hand-food-mouth（5h），2 day hand-food-mouth and encephalitis（2e），5day hand-food-mouth and encephalitis（5e）. Elisa and western blot were used to detect the expressions of certain signal pathway related proteins in blood. Results Elisa assay：the levels of interferon，JAK1，TYK2，STAT-1，STAT-2 protein expression in the groups of patients were signifi cantly increased than that of the corresponding control groups，（P<0.01），especially the 5h group，there was no signifi cant difference found between 2e group and 2h group，it was the same between 2e and 5e group. Conclusions The levels of the levels of interferon，JAK1，TYK2，STAT-1，STAT-2 protein expression in the groups of hand food mouth disease and encephalitis were signifi cant increased，but were expressed less than that groups of general hand food mouth disease，which suggest that JAK1/TYK2-- STAT-1/2 signal pathway has a great role in the diagnosis of hand food mouth disease and encephalitis.

EV71 Hand-food-mouth disease Encephalitis Interferon

浙江省溫州市科技局項目（Y20140500）

325000 溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院感染科