響應面法優化微波輔助提取蛇六谷生物堿工藝

陳文韜,林月珠,牛日華,項雷文

(福建師范大學福清分校,海洋與生化工程學院,福建福清 350300)

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響應面法優化微波輔助提取蛇六谷生物堿工藝

陳文韜,林月珠,牛日華,項雷文*

(福建師范大學福清分校,海洋與生化工程學院,福建福清 350300)

采用微波輔助提取法從蛇六谷中提取生物堿,并用酸性染料比色法進行定量分析,用紅外光譜對提取的生物堿進行定性分析。在單因素(乙醇濃度、料液比、提取溫度和時間)實驗的基礎上,選取料液比、微波提取溫度和提取時間三個因素進行響應面分析,從而對蛇六谷生物堿提取工藝進行優化。結果表明,經優化后的蛇六谷生物堿最佳提取工藝為:以95%的乙醇為提取劑,料液比為1∶20.4(g/mL),在微波消解儀中提取時間為8 min,提取溫度為60 ℃,此條件下蛇六谷生物堿得率為0.216%。

蛇六谷,生物堿,響應面法,微波輔助提取,紅外光譜

蛇六谷是天南星科魔芋屬(Amorphophallus)多年生草本植物的干燥塊莖,是江浙一帶的特色中藥材,尚未收入國家藥典[1]。蛇六谷塊莖中的成分以葡甘聚糖為主,此外還含有淀粉、生物堿、纖維素和礦物質等[2-3]。蛇六谷對人體消化道疾病、心血管疾病、糖尿病和肥胖癥等均具有一定的療效,并有防瘤抑癌的功效[4-5]。蛇六谷中含有20余種生物堿,是主要的活性成分之一,但目前對其藥學性及其作用機理尚不清楚[6-7]。

蛇六谷作為中藥,在煎煮過程中生物堿等物質會被浸提出來。因此,煎煮法在蛇六谷生物堿提取方法中應用最廣。煎煮法操作簡單,但提取過程中會造成易揮發和不穩定的生物堿的損失,如要進行工業化生產,煎煮法效率較低,同時難以進行質量控制。因此對蛇六谷生物堿高效提取方法的研究尤為重要。朱燕采用醇浸漬法多次提取,生物堿得率為0.496%[8];龍德清等采用酸性醇回流法、浸漬法提取生物堿,生物堿得率為0.47%[9-10];楊海濤等以微波法提取,并用正交實驗優化提取工藝,生物堿得率為0.428%[11];楊曉帆等以索氏提取,并用正交實驗優化提取工藝,生物堿得率為0.094%[12];孫天瑋等以酸性醇浸漬法提取,生物堿得率為0.09%[13];張志健等以酸性醇浸漬法提取,生物堿得率為0.1%[14];張忠良等分析結果表明,生物堿為0.134%[15]。文獻中生物堿得率從0.09%至0.5%不等,這是由于提取方法不同、所選取的研究對象(蛇六谷的不同部位,加工方式)不同所致。蛇六谷中總生物堿含量測定有比色法和重量法兩種,其檢測結果存在較大差異,這是由于重量法得到的產物中含有較多的雜質,準確性較酸性染料比色法要低。

本文采用酸性染料比色法測定總生物堿。在料液比、乙醇濃度、時間和溫度4個因素設計單因素實驗基礎上,用響應曲面法尋求優化微波輔助提取蛇六谷生物堿的最佳提取工藝,以期為蛇六谷生物堿提取提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蛇六谷片購于亳州藥材市場;鹽酸金剛烷胺(標準品)中國藥品生物制品檢驗所;鄰苯二甲酸氫鉀(AR)中國測試技術研究院;溴甲酚綠西亞試劑;三氯甲烷(AR)南京利勝化學試劑有限公司;碳酸鈉(AR)、氫氧化鈉(AR)、95%乙醇(AR)西隴化工股份有限公司。

UV754N紫外可見分光光度計上海佑科儀器儀表有限公司;雷磁PHS-3型pH計上海儀電科學儀器科學股份有限公司;FW100型高速萬能粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司;電子天平北京賽多利斯儀器系統有限公司;WX4000N型溫壓雙控微波消解儀奧普勒儀器有限公司;TDL-4型低速離心機上海安亭科學儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1原料預處理將蛇六谷片用萬能粉碎機粉碎,過100目篩,置于密封袋中,備用。

1.2.2蛇六谷生物堿測定

1.2.2.1標準儲備液配制準確稱取5 mg鹽酸金剛烷胺,用三氯甲烷溶解并定容至100 mL,得50 μg/mL標準儲備液。

1.2.2.2檢測波長的確定用50 μg/mL鹽酸金剛烷胺標準儲備液進行全波長(190～1100 nm)掃描,得出最適檢測波長。

1.2.2.3標準曲線的繪制鹽酸金剛烷胺標準儲備液用三氯甲烷稀釋得到0、2、4、6、8、10 μg/mL的待測溶液。分別加入5 mL pH4.5的鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、2 mL 0.04%溴甲酚綠溶液,搖勻,靜置30 min,取三氯甲烷層于最適檢測波長處測吸光度值。以鹽酸金剛烷胺標液濃度為橫坐標,以其相對應的吸光值為縱坐標,繪制標準曲線[11]。

1.2.2.4微波輔助法提取蛇六谷生物堿準確稱取一定量的蛇六谷粉末,按一定的料液比加入不同濃度的乙醇溶液,混合均勻;在一定的溫度和功率條件下微波提取一定的時間,而后以3000 r/min離心10 min,取全部上清液;用10%碳酸鈉溶液調節上清液pH至10,再次以3000 r/min離心10 min,取上清液,用三氯甲烷定容至6 mL;加入2.5 mL鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液,1 mL溴甲酚綠,搖勻,靜置30 min分層后取三氯甲烷層,將其稀釋至合適濃度,靜置15 min后在最適檢測波長處測吸光度。

根據公式(1)計算生物堿的含量：

式(1)

式中:A-吸光度;V-生物堿提取液調pH10離心后的上清液體積,mL;B-稀釋倍數;m-蛇六谷的質量,g。

1.2.3單因素實驗

1.2.3.1乙醇濃度對蛇六谷生物堿得率的影響準確稱取0.60 g蛇六谷粉末,按料液比1∶5(g/mL)分別加入65%、75%、85%、95%乙醇溶液和無水乙醇,在70 ℃下微波消解8 min,功率為30%,壓力為1.5 MPa條件下提取,按1.2.2.4步驟操作,測吸光度并計算得率。

1.2.3.2料液比對蛇六谷生物堿得率的影響分別準確稱取0.60、0.30、0.20、0.15、0.12 g蛇六谷粉末,按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)加入95%的乙醇,在微波70 ℃,功率30%,1.5 MPa壓力條件下提取8 min,按1.2.2.4步驟操作,測吸光度并計算得率。

1.2.3.3提取溫度對蛇六谷生物堿得率的影響準確稱取0.15 g蛇六谷粉末,按料液比1∶20(g/mL)加入95%的乙醇溶液,分別在40、50、60、70、80 ℃下微波消解,功率為30%,1.5 MPa壓力條件下提取8 min,按1.2.2.4步驟操作,測吸光度并計算提取率。

1.2.3.4提取時間對蛇六谷生物堿得率的影響準確稱取0.15 g蛇六谷粉末,按料液比1∶20(g/mL)加入95%的乙醇溶液在60 ℃下微波消解,功率為30%,1.5 MPa壓強條件下分別提取4、8、12、16、20 min,按1.2.2.4步驟操作,測吸光度并計算得率。

1.2.4響應曲面法實驗設計在單因素實驗的基礎上,根據Design-Expert 8.0.5 b軟件中Box-Behnken原理,選取料液比、微波提取溫度和提取時間3個因素用響應面優化蛇六谷生物堿提取實驗,每個因素設低、中、高3水平,分別用代碼-1、0、+1表示,實驗因素與水平設計見表1。

表1　蛇六谷生物堿提取Box-Behnken實驗因素及水平Table 1　Factors and levels of Box-Behnken expetiments for the extraction of Konjac alkaloids

1.2.5紅外光譜定性分析按優化后的工藝提取得到生物堿提取物,先將三氯甲烷蒸發得到棕色濃稠狀固體,再將該稠狀物置于恒溫箱70 ℃干燥24 h,最后呈棕褐色膏狀固體,在紅外光譜儀中掃描得到其圖譜,與標準圖譜相比較進行定性分析。

1.3數據處理

數據使用Design-Expert 8.0.5b軟件分析。

2　結果與分析

2.1標準曲線制作

對鹽酸金剛烷胺標準溶液進行全波長(190～1100 nm)掃描,其圖譜如圖1所示。

由圖1可知,鹽酸金剛烷胺溶液在可見波長(1100～550)nm區域無吸收,從550 nm才有吸收,在414 nm吸收達到最高,而后隨著波長變短,吸光度下降。因此,鹽酸金剛烷胺最大吸光波長為414 nm,以此為檢測波長。

圖1　鹽酸金剛烷胺紫外光譜圖Fig.1　UV spectrum of amantadine hydrochloride

以鹽酸金剛烷胺標準樣品濃度(X)與所得吸光度(Y)作圖,標準曲線回歸方程為Y=0.0667X-0.0135,r=0.9953,這表明鹽酸金剛烷胺標準物質在2～10 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2單因素對蛇六谷生物堿得率的影響

2.2.1乙醇濃度對蛇六谷生物堿得率的影響乙醇濃度對蛇六谷生物堿得率的影響如圖2所示。

圖2　乙醇濃度對蛇六谷生物堿得率的影響Fig.2　Effect of ethanol concentration on the extraction rate of alkaloids from Konjac

由圖2可知,在微波輔助提取過程中,隨著乙醇濃度增加,生物堿得率也相應增加。當乙醇濃度達到85%后,曲線趨于平緩,說明乙醇溶度在85%以上時得率變化較小,考慮到提取成本,因此選擇95%乙醇作為蛇六谷生物堿的提取溶劑。

2.2.2料液比對蛇六谷生物堿得率的影響在微波提取過程中,蛇六谷質量與提取溶劑的比例(料液比)是重要影響因素,料液比對蛇六谷生物堿得率的影響如圖3所示。

圖3　料液比對蛇六谷生物堿得率的影響Fig.3　Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of alkaloids from Konjac

由圖3可知,隨著料液比的增大,生物堿得率也隨之增加,當料液比達到1∶20(g/mL)時,再增加料液比,生物堿的得率反而下降。這可能是因為隨著料液比的增加,雜質的溶出也增加,抑制生物堿的提取或影響了生物堿的測定,同時在生產中會消耗更多的溶劑和能量。因此確定最佳料液比為1∶20(g/mL)。

2.2.3提取溫度對蛇六谷生物堿得率的影響提取溫度對蛇六谷生物堿得率的影響如圖4所示。

圖4　微波提取溫度對蛇六谷生物堿得率的影響Fig.4　Effect of microwave temperature on the extraction rate alkaloids from Konjac

由圖4可知,隨著微波溫度的增加,生物堿得率呈上升趨勢,當溫度達到60 ℃時,生物堿得率最高,之后隨溫度升高反而降低,這可能是溫度升高導致生物堿結構不穩定,發生了分解。另外溫度太高,乙醇揮發較為嚴重,也影響了生物堿的提取。因此最佳提取溫度為60 ℃。

2.2.4提取時間對蛇六谷生物堿得率的影響提取時間對蛇六谷生物堿得率的影響如圖5所示。

圖5　微波浸提時間對蛇六谷生物堿得率的影響Fig.5　Effect of microwave time on the extraction rate of alkaloids from Konjac

由圖5可知,微波恒溫時間在8 min內,蛇六谷生物堿得率隨時間延長而上升;當微波時間為8 min時,生物堿得率最高;此后,隨著提取時間的延長得率并未增加反而下降。這可能是微波對生物堿有消解作用,故取8 min為微波浸提生物堿最佳時間。

2.3響應曲面法優化實驗

Box-Behnken的3因素3水平實驗共17個實驗點。其中,12個是析因點,自變量取值在A、B、C所構成的三維頂點;5個是零點,為區域的中心點,用來估計實驗誤差,蛇六谷生物堿得率見表2。采用Design-Expert 8.0.5b軟件對表2實驗數據進行回歸分析及多元回歸擬合,實驗方差分析如表3所示。

表3　蛇六谷生物堿提取Box-Behnken實驗方差分析Table 3　Analysis of variance of Box-Behnken experiment for the extraction of alkaloids from Konjac

注:*表示模型或考察因素有顯著影響(p<0.05);**表示模型或考察因素有極顯著影響(p<0.01)。

響應面分析實驗各因素之間的響應曲面圖如圖6～圖8所示。

表2　蛇六谷生物堿提取Box-Behnken實驗結果Table 2　Design and results of Box-Behnken experiment for the extraction of alkaloids from Konjac

圖6　料液比、提取溫度交互作用 對蛇六谷生物堿得率的響應面圖Fig.6　Response surface of the effects of solid-liquid ratio and microwave temperature on the extraction rate of alkaloids from Konjac

圖7　料液比、提取時間交互作用 對蛇六谷生物堿得率的響應面圖Fig.7　Response surface of the effects of solid-liquid ratio and microwave time on the extraction rate of alkaloids from Konjac

圖8　提取溫度、提取時間交互作用 對蛇六谷生物堿得率的響應面圖Fig.8　Response surface of the effects of microwave temperature and microwave time on the extraction rate of alkaloids from Konjac

從圖6可以看出,在提取時間8 min時,提取溫度和料液比兩個因素交互作用顯示,在提取溫度57～63 ℃,料液比1∶18～1∶22的范圍內蛇六谷生物堿得率可達實驗最佳值。由圖7響應曲面的彎曲程度可知,料液比與提取時間的交互作用對蛇六谷生物堿得率影響顯著,表現為曲面較陡呈鐘罩型。在提取溫度為60 ℃時,提取時間和料液比兩個因素交互作用顯示,在提取時間7～9 min,料液比為1∶18～1∶22的范圍內蛇六谷生物堿得率可達實驗最佳值。從圖8可以看出,在料液比為1∶20時,提取時間和溫度兩個因素交互作用顯示,在提取時間7.5～9 min,提取溫度58～62 ℃的范圍內蛇六谷生物堿得率可達實驗最佳值。由于微波浸提時間和溫度的交互作用對蛇六谷生物堿得率影響不顯著,在圖8響應面上表現為曲面較為平緩。

響應面值最大時,X1、X2、X3對應的編碼值分別為0.076、0.001、0.068,與之對應的蛇六谷生物堿微波輔助提取的最佳工藝條件為:料液比1∶20.38(g/mL),恒溫溫度60.01 ℃,微波時間8.14 min。此時,蛇六谷生物堿的理論得率為0.218%。

為檢驗響應面的可靠性,采用最佳提取工藝條件對蛇六谷生物堿提取進行實驗驗證,同時考慮到實際操作的便利性,將工藝參數修正為料液比1∶20.4(g/mL),恒溫溫度60 ℃,微波時間8 min。在此條件下做3次平行實驗測得蛇六谷生物堿得率為0.216%±0.006%,與理論預測值0.218%基本吻合,說明采用響應面法優化得到的提取條件準確可靠,具有實用價值。

2.4蛇六谷生物堿紅外光譜分析

蛇六谷提取物濃縮后得到的棕褐色膏狀物在紅外光譜儀中掃描得到其圖譜,如圖9所示。

圖9　生物堿紅外光譜圖Fig.9　The IR spectra of alkaloid from Konjac

圖9與文獻[16]對比可知,3438.38 cm-1出峰,可知樣品含活性氫,如-NH2、-NH、-OH等,而2923.7、2854.82 cm-1及1384.708 cm-1峰為-CH3、-CH2-,1729.92 cm-1峰則為C=C、C=N或C=O,1639.28 cm-1峰可能是C=C,圖9中各個峰值相似,為生物堿類化合物。

3　結論

以鹽酸金剛烷胺標樣,采用酸性染料比色法對從蛇六谷中提取的生物堿進行測定。通過紫外可見波長掃描,確定鹽酸金剛烷胺標樣的最大吸收波長為414 nm,并選擇此波長作為檢測波長。在單因素實驗的基礎上,根據Box-Behnken原理設計實驗,通過響應面分析,得到最佳微波提取條件為:乙醇濃度95%,料液比1∶20.4(g/mL),恒溫溫度60 ℃,微波時間8 min。在此條件下做驗證實驗,得到蛇六谷生物堿得率為0.216%,與理論預測值0.218%較為吻合,說明建立的響應模型穩定可靠,適用于蛇六谷生物堿提取工藝的優化。并由紅外光譜確認蛇六谷提取物為生物堿。

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Optimization of microwave-assisted extraction for Konjac alkaloids by response surface methodology

CHEN Wen-tao,LIN Yue-zhu,NIU Ri-hua,XIANG Lei-wen*

(School of Ocean Science and Biochemistry Engineering,Fuqing Branch of Fujian Normal University,Fuqing 350300,China)

The microwave-assisted extraction,infrared spectrum qualitative analysis and the acid dye colorimetry for quantitative analysis were carried out on the alkaloids from Konjac. Based on the single-factor(ethanol concentration,solid-liquid ratio,microwave time and temperature)tests,taken the solid-liquid ratio,extract temperature and extract time as independent variables and the content of the alkaloids from Konjac as dependent variable,the extract parameters of the alkaloids from Konjac were optimized by response surface methodology. The results showed that the optimized extract parameters were 95% ethanol as extraction solvent,solid-liquid ratio was 1∶20.4(g/mL),extract time was 8 min,extract temperature was 60 ℃. Under the optimized extract conditions,the extraction rate of alkaloid reached 0.216%.

Konjac;alkaloid;response surface methodology;microwave-assisted extraction;infrared spectrum

2015-12-22

陳文韜(1969-),男,博士,教授級高工,主要從事天然產物綜合利用、多組分高分子材料加工等方面的研究,E-mail:cwt282@163.com。

項雷文(1975-),男,博士,副教授,主要從事天然產物綜合利用、生物大分子分離與表征、食品中美拉德反應等方面的研究,E-mail:xiangleiwen@163.com。

福建省教育廳、福建省科技廳項目(JK2010064);福建省省級重點學科“食品科學與工程”建設項目(閩教高[2012]48號)。

TS255.36

B

1002-0306(2016)14-0257-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.043