腸道微生物體外發酵模型研究進展及其在食品中的應用

支梓鑒,俞邱豪,程　煥,陳健樂,葉興乾,陳士國

(浙江大學,生物系統工程與食品科學學院,馥莉食品研究院,浙江省農產品加工技術研究重點實驗室,浙江杭州 310058)

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腸道微生物體外發酵模型研究進展及其在食品中的應用

支梓鑒,俞邱豪,程煥,陳健樂,葉興乾,陳士國*

(浙江大學,生物系統工程與食品科學學院,馥莉食品研究院,浙江省農產品加工技術研究重點實驗室,浙江杭州 310058)

隨著分子微生態學,特別是高通量測序技術的快速發展,人們對腸道微生物的作用有了進一步認識。腸道不僅是消化吸收的場所,其微生物菌群現更被認為是一個高度特異化的“器官”,其代謝活力直接影響人體的健康。但直接對人體或動物模型腸道內容物取樣進行研究,操作復雜且有悖道德倫理,因此近來體外腸道發酵模型成為研究熱點,為此類研究提供了一個新的可行性途徑。本文綜述了體外發酵模型的研究進展及其在食品功能研究中的部分應用,并結合相關高通量檢測技術發展提出展望,以期為腸道微生物或食品代謝等相關研究提供一定的參考依據。

腸道微生物,體外發酵模型,高通量測序

人體腸道菌群是高度復雜多樣性的微生物菌落,其數量眾多、種類豐富,廣泛參與人體多種生理活動,對人體健康起著至關重要的作用[1-4]。正常成年人腸道微生物主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、梭桿菌門和疣微菌門[5],其中,擬桿菌門和梭桿菌門參與分解代謝產生乙酸、丙酸和丁酸鹽,抑制炎癥和結腸癌;雙歧桿菌、乳酸桿菌可合成部分維生素,促進腸道蠕動,抑制致病菌生長;真桿菌和一些梭菌代謝產生次級膽酸,提高膽固醇含量,具有誘變和致癌作用[6]。同時,近些年研究表明,人體腸道不僅負責食物加工,而且其微生物菌群與心情、免疫、肥胖、糖尿病、大腸癌、心腦血管疾病等有著密切關系[3-4,7]。

目前,腸道微生物生物組成和多樣性評價主要集中于利用宏基因組學等方法檢測糞便樣品,但這僅代表了遠端大腸的菌群特征。然而這些研究并未提供深入探討動態微生物進程和腸道特定位置功能或消化性能的信息。體外發酵模型從簡單的厭氧環境中糞便微生物的批量發酵到復雜的一級或多級連續發酵模型,為其逐步演變為科學研究提供了更多可能。體外發酵模型是研究大量底物篩選的有效工具,其中包括膳食組分、藥物和有毒或放射性組分,同時也可對腸道微生物環境的變化進行測定。模型的主要目的是在可控條件下培育復雜腸道微生物菌群,用于微生物調控和代謝的相關研究。目前,有關體外發酵模型和腸道微生物的相關研究已成為食品領域的新熱點,但還比較薄弱,需要進一步深入研究。本文就國內外目前經典的體外腸道模型及其發展和應用進行綜述,旨在加快該領域的發展。

表1　體外發酵模型特定及其局限性Table 1　The characteristics and limitations of in vitro fermentation models

1　體外發酵模型

從單一發酵罐到多相連續發酵系統,體外發酵模型的設計和復雜性隨著接種技術的發展而不斷升級[8-11]。模型均需特定的時間使完整的微生物菌群處于穩定狀態,因此需根據研究目標進行不同的選擇,其中,模型種類、特點及其局限性如表1所示。

1.1批式發酵模型

批式發酵是單一或混合細菌懸浮液在特定選擇培養液中進行發酵,期間不再添加新的營養物,且模型一般為密封瓶子或反應器,保證其厭氧環境。此模型具有簡單、易操作和價格低廉等優點。然而,在實驗過程中,微生物發酵會導致短鏈脂肪酸產生并積累,從而造成發酵系統中pH的改變,影響發酵正常進行。系統中微生物的生長主要依靠接種濃度和底物消耗速率控制。低細胞濃度接種的系統呈現出典型的S-型生長曲線,發酵前期存在豐富營養物,隨后營養物被消耗,同時產生有毒代謝產物積累,生長受到抑制。微生物菌群的評價和微生物代謝調控等復雜性實驗需要連續性的底物補給,否則,發酵時間會大大縮短，從而抑制體外穩定條件的形成。因此,此模型僅適用于短期發酵的相關研究,以及底物對腸道微生物生理和生物多樣性的影響。如抗性淀粉和果聚糖等碳水化合物是否具有益生元潛力[12-13],以及食物組分被腸道微生物作用時短鏈脂肪酸短期代謝情況研究[14]。

1.2連續發酵模型

連續發酵模型克服了批式發酵模型的一些弱點,通過連續補充營養底物,同時轉移有毒代謝產物,達到延長微生物發酵時間的目的。連續發酵模型分為單相和多相連續發酵模型,其中,單相發酵模型能夠較好模擬盲腸和升結腸的消化情況,因此常被用于闡明近端結腸功能和代謝活力[9]。

然而,人體腸道環境是一個多相環境,分為升結腸、橫結腸和降結腸三個區域,每個區域在代謝活力和微生物組成上均存在差異。因此,多相連續發酵模型設置不同反應器模擬腸道不同階段,能更準確模擬腸道生態環境。Macfarlane等[15]開發出三相發酵模型,如圖1所示,圖中Vessel 1、Vessel 2和Vessel 3三個恒化器串聯模擬近端、橫向、遠端結腸區域,其體積分別為0.22、0.32和0.32 L,pH分別為5.5、6.6和6.8,系統溫度維持在37 ℃,且充入CO2保持厭氧環境。整體系統參數按照人體生理情況進行設定,實現發酵在空間、時間、營養和理化特性上的準確性和合理性。此外,微生物接種液轉移至發酵模型過程中的適應、生長和增殖均要依靠環境參數,如pH、保留時間、溫度、厭氧環境和介質流速,因此實驗過程中嚴格控制參數是構建微生物組成和代謝活力穩態的關鍵。

圖1　三相發酵模型示意圖Fig.1　Schematic diagram of the three-stage fermentation model

圖2　五相發酵模型示意圖Fig.2　Schematic diagram of the five-stage fermentation model

1993年,Molly等[16]開發SHIME(The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem)模型。它是一個五相發酵模型,包含五部分組件,分別模擬了食物經過上消化道(胃部、小腸)和下消化道(升結腸、橫結腸和降結腸)整個過程。整個SHIME反應器應在37 ℃進行工作,反應器均為雙層夾套的玻璃容器,且通過磁力攪拌進行混合溶液。研究人員需每天添加3次營養液至胃室,胰液和膽汁至小腸室。在胃和小腸室內消化的基礎上,懸浮液在泵作用下抽入升結腸容器進行結腸消化。消化液在反應器中的保留時間可根據研究目的通過改變流速進行調整,胃室、小腸室、升結腸室、橫結腸室、降結腸室反應體積分別為0.2、0.3、0.7、1.3、0.8 L,保留時間分別為2、6、18、36、22 h,pH分別為2、6.8、5.6～5.9、6.1～6.4和6.6～6.9。同時,整個模型通過頂端空間充入氮氣或N2/CO2(9∶1)來維持厭氧環境。

粘膜微生物是腸道微生物生態系統的重要組成部分,它與腔內微生物在菌群組成上存在本質區別,且定居于腸道上皮細胞的粘液,因此,粘膜微生物對調節腸道健康有更高效能[17]。Abbeele等發現柔嫩梭菌(aecalibacterium prausnitzii)的存在能夠抑制克羅恩病的發生[17]和術后復發[18]。隨后,Abbeele等[19]通過黏蛋白覆蓋微生物群來模擬粘膜微生物群落,梭狀芽孢桿菌IV和XIVa產生大量丁酸并轉運至結腸細胞,加強細胞間連,提高腸道屏障功能。同時,研究表明,M-SHIME模型能夠維持個體微生物群落中粘膜微生物組成特有屬性。

此外,為解決發酵過程中系統游離細胞不易控制等問題,細胞固定化技術與連續發酵聯用以期達到持久發酵等目的,其中,應用最為廣泛固定化技術的是多孔糖基質固定化。固定化細胞轉移至營養生長液后,受到底物和產物擴散的限制,能夠在糖基質上形成高細胞密度層(1010～5×1011),隨后細胞釋放在培養液中,并維持高細胞活力。研究發現[20],細胞固定化發酵過程中,乳酸菌和雙歧桿菌數量明顯優于傳統游離細胞發酵,同時,可防止長期連續發酵時沖洗現象,減少污染敏感性和噬菌體攻擊,增強質粒穩定性,防止細胞受到磁力攪拌剪切力影響。因此,Cinquin等[11]利用固定化的糞便微生物模擬腸道發酵,固定化復合糞便微生物模型能快速達到系統平衡,維持高細胞密度,并能利用預固定化基質進行多參數實驗,同時可通過修飾細菌生理參數改善腸道模型。

1.3自動化發酵模型

隨著科技的快速發展,計算機控制系統推動了發酵模型的進一步發展。Minekus等[21]開發出一項新型電腦控制的腸道發酵模型——TIM-2模型，如圖3所示。發酵裝置主要由四部分相互連接的玻璃腔室(a)組成,每個腔室內部均有一個彈性薄膜。在玻璃夾套和彈性膜之間泵入37 ℃水維持恒溫環境,通過改變泵入水壓造成彈性膜壓縮或舒張來模擬腸道蠕動,同時形成蠕動波推動食糜內容物在環形體系中移動。TIM-2模型系統pH由pH電極(b)在線監測,并通過添加1 mol/L NaOH(c)中和微生物產生的酸性物質控制pH恒定在5.8左右。為防止代謝產物累積造成微生物菌群生長抑制或死亡,系統配備一個由中空纖維膜構成的透析系統(d),它能夠截留50000 u的分子,穩定模型中微生物代謝產物的生理濃度,如短鏈脂肪酸生理濃度為80～120 mmol/L,從而維持系統3周的微生物活力。隨著透析液和食物的攝入和增加,系統體積不斷增加,當達到一定體積后,水平檢測器(e)激活排出閥,維持內容物體積在120 mL左右的水平。此外,系統持續吹入氮氣(f)保證厭氧環境,加之微生物活力,使得系統氧化還原電位穩定在300 mV左右。實驗過程中,可通過取樣口(g)或回收透析液(d)進行取樣。該模型的優點是存在蠕動和透析系統以維持代謝產物的生理濃度和正常濃度下的高微生物活性,同時,可改變單參數研究對微生物代謝活力的影響。但TIM-2模型僅動態模擬了大腸發酵的環境,為了達到更好的模擬效果,該模型可與TIM-1模型連用,模擬整個人體消化道生理環境。

圖3　TIM-2示意圖Fig.3 Schematic diagram of TIM-2 注:(a)蠕動室；(b)pH電極；(c)堿液泵；(d)含有中空纖維膜的透析液回路；(e)水平檢測器；(f)N2入口；(g)取樣口；(h)氣體出口；(i)回腸流出液集中室；(j)溫度檢測器。

SIMGI(SIMulator Gastro-Intestinal)也是一個體外自動化發酵模型,通過內置編程軟件的操作板控制動態模擬從胃、小腸消化到大腸發酵、生物代謝轉換等完整生理過程[22]。其中,升結腸、橫結腸和降結腸pH分別為5.6±0.2、6.3±0.2和6.8±0.2,體積分別為250、400和300 mL。發酵營養液包含阿拉伯半乳聚糖(1 g/L)、蘋果果膠(2 g/L)、木聚糖(1 g/L)、土豆淀粉(3 g/L)、葡萄糖(0.4 g/L)、酵母提取物(3 g/L)、蛋白胨(1 g/L)、黏蛋白(4 g/L)、L-半胱氨酸(0.5 g/L)。該模型的主要優點是靈活性的組件和自控化控制參數模擬生理條件,同時具有胃和小腸排空功能,但模型需14 d的穩定周期后才能進行實驗,實驗周期較長。同樣,模型缺少腸道菌群與宿主間的相互作用,可嘗試將上皮細胞和免疫細胞共培養模擬腸道生理環境。

圖4　SIMGI模型示意圖Fig.4　Schematic diagram of the SIMGI

2　體外消化模型在食品中的應用

2.1食品組分對腸道微生物菌群變化的研究

人體腸道菌群種類復雜、數量豐富,高達1013～1014,超過人體細胞總數10倍,所編碼的基因是人類基因組的150倍以上[1-2]。腸道微生物與其代謝產物在人體能量代謝、營養物質吸收、先天和獲得性免疫、胃腸道功能等方面發揮主要作用[23]。此外,腸道微生物菌群的組成易受年齡、體重、性別、飲食[24]等因素影響,因而不同人群的腸道菌群表現出個體差異性。Kemperman等[25]利用SHIME模型研究了紅茶和葡萄酒中酚類物質對腸道微生物的影響,研究發現,兩種酚類提取物均可選擇性抑制腸道致病菌,且能夠使厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)比例發生變化。紅茶酚類提取物刺激克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸球菌(Enterococci)和Akkermansia生長,抑制雙歧桿菌(Bifidobacteria)、B.coccoides、Anaeroglobus、食物谷菌屬的生長;葡萄酒中酚類物質能夠促進克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、Alistipes、Cloacibacillus和Victivallis的生長,減少雙歧桿菌(Bifidobacteria)、B.coccoides、Anaeroglobus、Subdoligranulum和擬桿菌門(Bacteroidetes)的數量。但Parker等[26]則認為對腸道微生物起調節作用的是酚類物質的代謝物,而非多酚本身。Abbeele等[27]利用SHIME模型和TIM-2模型研究長鏈阿拉伯木聚糖和菊粉的發酵方式的區別,實驗證明,長鏈阿拉伯木聚糖和菊粉能夠分別增加丙酸和丁酸代謝產物的含量,阿拉伯木聚糖促進長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)生長,而菊粉選擇性促進青春雙歧桿菌生長。此外,Kortman等[28]研究了利用體外模型鐵補充劑對腸道微生物代謝的影響,研究表明,鐵離子的補充會造成雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)和乳酸菌科(Lactobacillaceae)水平降低,羅斯氏菌屬(Roseburia)和普雷沃菌屬(Prevotella)水平升高,代謝產生的支鏈脂肪酸和氨的含量顯著增加,同時,在富含鐵條件下,其代謝液對Caco-2細胞毒性增加。

2.2腸道微生物對功能因子代謝酵解研究

膳食中的功能多糖和多酚類物質等在進入腸道后,易受到腸道微生物作用而發生一定的代謝降解,進而發揮生理功能。Hu等[29]利用體外發酵模型研究車前子多糖在大腸酵解中的變化,結果表明,以乙酸、丙酸和正丁酸為主要組成成分的短鏈脂肪酸總量隨酵解時間的增加而增加,其中,乙酸和正丁酸的增加主要是由于車前子多糖中葡萄糖醛酸和木糖的酵解,而丙酸的增加主要是由于多糖中阿拉伯糖和木糖的酵解。同樣,Min等[30]發現青錢柳葉多糖在體外模型酵解過程中短鏈脂肪酸含量增加,多糖被部分酵解,與半乳糖醛酸相連的糖苷鍵更容易被腸道微生物攻擊。Gonthier等[31]利用批量發酵模型研究綠原酸的降解路徑,綠原酸的酯鍵在腸道微生物作用下發生水解,并通過脫羧反應、雙鍵還原反應或去羥基化反應轉化為乙基兒茶素或3-羥基苯甲酸,后經β-氧化形成苯甲酸。

3　展望

3.1體外腸道發酵模型的接種和重現性

盡管存在多種體外發酵模型的組合設計,但仍然存在許多挑戰和局限制約著這項技術的發展。體外模型中腸道微生物的重現性和功能穩定性頻受質疑,模型穩定性主要依據實驗因素對微生物組分和代謝活力的影響,而并非腸道微生物對模擬腸道環境的適應能力。在環境因素和初始菌種多樣性等條件下,系統在接種和增殖后腸道微生物會形成新的平衡。近幾年研究發現,利用腸芯片技術檢測TIM-2和SHIME模型中微生物分布,細菌比例會產生明顯差異[8,32]。嚴格、可重復性的糞便收集過程在發酵過程中起著至關重要的作用,其能夠保證接種液新鮮度,并決定其在腸道中的增殖速率。模型中菌種還受到連續取樣等因素影響而發生不斷變化,也易造成生物重現性差等現象。因此,開發出在線可控腸道微生物模型,嚴格準確監控模型參數至關重要。

3.2功能穩定的體外腸道發酵模型的“組學”分析

蛋白質譜測序技術已成功發掘了腸道菌群發酵過程(體內及原位)中復雜的交互作用及其代謝的主要途徑,但是對體外菌群的發酵機制的研究仍不清楚[33-35]。目前,“組學”技術在體外發酵模型中的應用僅局限于利用微陣列技術或SIP技術進行系統發生分析[8,32,36]。SIP技術應用于微生物代謝中,用13C標記底物追蹤菌群代謝中某一物質的路徑[37-38]。宏基因組學研究技術在各種實驗條件下對特定的人體腸道菌群潛在的基因進行分類,表明組學技術可用于研究人體腸道菌群[39-40]。盡管宏基因組分析技術能夠提供菌群潛在的基因,但并不代表具有此類基因的菌群具有相應的功能。環境轉錄組學在環境微生物生態學方面的研究進展提高了識別基因表達所引起功能變化的能力[34,41]。然而,由于翻譯后調控等機制的存在,環境轉錄組學所研究出來的結果并不能明確的說明mRNA豐度與其轉錄出的蛋白活性有直接的關系。從復雜的生物樣品中提取、分離、純化和鑒定蛋白質等方法上的缺陷仍阻礙著人類腸道菌群功能相關的蛋白組學的進一步發展[42]。代謝和細胞內的生化過程產生大量的代謝產物,并被分配給腸道內特定菌群供其發揮功能,這可能由代謝組學技術來闡明此類研究[43-44]。人體腸道微生物作用下的酚類代謝研究就是利用蛋白質測序技術識別菌群和代謝間交互作用的重要例子。同時,鑒于薈萃分析技術的研究進展,生物信息學領域面臨的最大挑戰可能在于建立完善的基因數據庫,發明更快、更簡單的分析方法用以分析來自于高通量測序和代謝組學分析腸道微生物相關信息所產生的大量數據。

3.3體外模型的應用展望

闡明人類腸道菌群在體外模型中的調控機制和代謝概況需要“組學”為基礎的檢測技術。多學科系統研究法結合“組學”技術將促成新的研究系統去推動復雜微生物和宿主因素對人類腸道微生物功能性相關研究。體外腸道發酵模型無法有效模擬宿主響應是目前面臨的主要技術難題,但宿主應答可通過體外酵解模型和體外小腸細胞模型結合來實現,如Caco-2細胞[45]。未來體外發酵模型系統還應涉及“患病者”微生物群的建立和穩態,使其便于進行炎性腸疾病中腸道微生物功能性的研究,如克羅恩疾病和潰瘍性結腸炎,且目前這些疾病病理學研究主要集中在復雜的免疫系統功能[46]。基于體外模型的不斷發展,也可促進免疫系統之外疾病的相關研究,同時關于腸道微生物的研究為“人體腸道系統生物學”方法提供了新的契機。

4　結論

體外發酵模型是一種創新技術平臺,其最大優點能夠表現出優良的實驗性能,同時不受人類道德約束。但大量體外發酵模型僅模擬了宿主部分腸功能,且微生物菌群平衡仍然是面臨的一個重大挑戰。然而,在實驗中宿主機能不能被完全忽略,因此可結合人體腸道細胞提供宿主應答等信息,為體外研究提供更加準確的結果。鑒于更準確實現體內研究結果,必須結合體外和體內模型進行結果互補,這樣不僅能加強體外模型的整體有效性,同時可區分腸道微生物與人體間的功能關系。目前,我國學者在體外腸道模擬研究腸道菌群結構和功能領域的研究相對較少,歸根到底是模型建立存在一定問題,因此,進一步完善和開發體外腸道模型,在線精確控制進程參數等工作亟需加強。此外,利用體外模型相關實驗,不能僅停留在表觀微生物改變和代謝產物的變化,梳理酵解過程中食品成分結構變化及相關機理才是未來發現的新方向。

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Advances ininvitrofermentation model of gut microbiota and its applications in food

ZHI Zi-jian,YU Qiu-hao,CHENG Huan,CHEN Jian-le,YE Xing-qian,CHEN Shi-guo*

(College of Biosystems Engineering and Food Science,Fuli Institute of Food Science,Zhejiang Key Laboratory for Agro-food Processing,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

With the rapid development of molecular microbial ecology,especially high-throughput sequencing technology,people have a better understanding of gut microbial communities. Intestinal is more than a place of digestion and absorption of food component,and the gut microbiota inside is even regarded as a highly specialized organ whose metabolic activity has a direct impact on human health. However,direct sampling from human or animal model is complex and contrary to ethics. Thus,invitrogut fermentation model presents a novel system for relevant research. This paper summarized the advances ininvitrofermentation models and their applications in functional food research,and proposes the forecast combined with the high-throughput sequencing technology,aiming to provide valuable references for in-depth study on gut microorganism and the metabolism of food.

gut microbiota;invitrogut fermentation model;high-throughput sequencing technology

2016-01-06

支梓鑒(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail：zhizijian8866@163.com。

陳士國(1982-)，男，副教授，研究方向：糖化學和糖生物學，E-mail：chenshiguo210@163.com。

國家自然科學基金(31301417)；浙江省公益項目(2014C32G2010026)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)14-0353-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.062