刺五加提取物對牡蠣蛋白酶解產物抗疲勞效果的強化作用

常　格,秦小明,章超樺,陳建平

(廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室,國家貝類加工技術研發分中心(湛江),廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088)

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刺五加提取物對牡蠣蛋白酶解產物抗疲勞效果的強化作用

常格,秦小明*,章超樺,陳建平

(廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室,國家貝類加工技術研發分中心(湛江),廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088)

在牡蠣蛋白酶解物中添加具有抗疲勞效果的刺五加提取物,以強化其抗疲勞效果,通過小鼠力竭實驗進行評價。將昆明小白鼠隨機分為陰性對照組、牡蠣蛋白酶解物組、低劑量刺五加提取物(0.14 g/kg)與牡蠣蛋白酶解物復合組、中劑量刺五加提取物(0.70 g/kg)與牡蠣蛋白酶解物復合組、高劑量刺五加提取物(2.10 g/kg)與牡蠣蛋白酶解物復合組、刺五加提取物組。然后,對每組小鼠灌胃給藥4周。通過小鼠力竭游泳實驗測定小鼠力竭游泳時間、肝糖原含量、血清尿素氮值、以及血乳酸值四個指標來確定樣品的體內抗疲勞效果。結果表明,綜合所有抗疲勞指標來看,牡蠣蛋白酶解物組游泳時間(p<0.05)、肝糖原含量(p<0.05)和乳酸含量(p<0.01)這三項指標顯示陽性,表明其具有抗疲勞效果。而添加刺五加提取物后,中劑量刺五加提取物(0.70 g/kg)與牡蠣蛋白酶解物復合組在本實驗中的一項運動指標及三項生化指標中均顯示陽性(p<0.01),這表明,相比單獨的牡蠣蛋白酶解物組,中劑量刺五加提取物(0.70 g/kg)與牡蠣蛋白酶解物復合組具有更好的抗疲勞效果。因此可以得出結論,添加中劑量的刺五加提取物確實可以強化牡蠣蛋白酶解物的抗疲勞作用效果。本文研究明確了刺五加提取物可以增強牡蠣蛋白酶解物的抗疲勞效果,為其進一步開發成高效的抗疲勞保健食品提供了可能。

牡蠣蛋白酶解物,刺五加提取物,小鼠力竭游泳實驗,抗疲勞效果

疲勞是人經過連續的體力勞動和腦力勞動后,工作能力暫時下降的一種狀態[1]。當今社會的快節奏工作生活狀態給人們帶來了巨大的壓力,多數人因為過度的疲勞處于亞健康狀態,嚴重影響了人們的工作效率和生活質量。與此同時,在運動領域和軍事領域,由于環境條件的苛刻,對于抗疲勞產品的效果也有較高的要求。因此,高能效的抗疲勞藥品及功能食品的研究具有非常重要的意義[2-3]。

作為我國首批列為藥食同源的保健療效食品之一的牡蠣,味道鮮美,具有低脂肪高蛋白的特點,并有“海洋牛奶”的美稱[4-5]。吉宏武等人對牡蠣肉水解物營養成分進行分析發現,牡蠣水解物中含有大量的牛磺酸、礦物質等多種具有抗疲勞作用的營養成分,并以動物實驗證明近江牡蠣肉水解物有較好的抗疲勞效果[6]。而張騫從牡蠣中提取出的牡蠣糖原也已通過小鼠實驗證明其具有抗疲勞作用[2]。但目前尚未有對牡蠣的抗疲勞能力的強化的研究。本文以營養價值較高的牡蠣作為載體,添加具有抗疲勞功效的物質,在補充各種營養的同時又能有效地提高牡蠣產品的抗疲勞作用。

選擇添加物質的原則要符合“天然無毒害作用”以及“抗疲勞功效強”特點。作為衛生部公布的可用于保健食品的物品的刺五加,具有益氣健脾,補腎安神的功效[7]。有大量研究表明,中藥刺五加含有與人參相似的多種皂甙且抗疲勞作用強于人參[8]。戎愛群等人以刺五加、黃芪等組成的復方,通過研究證明了刺五加復方具有抗疲勞作用[9]。而同樣的,路子佳等人也證明了刺五加復加西洋參而成的中藥保健膠囊具有抗疲勞作用[10]。因此,本研究擬采用動物蛋白水解酶對牡蠣肉蛋白進行酶解制備酶解產物,添加不同劑量的刺五加提取物,探討刺五加對牡蠣肉蛋白酶解產物的抗疲勞強化作用,為開發高能抗疲勞產品奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮近江牡蠣肉購于廣東湛江東風市場;動物蛋白水解酶(測得酶活為16×104U/g)購于廣西南寧龐博生物工程有限公司;刺五加提取物(刺五加甙B+E含量為1.3%)購于陜西錦泰生物工程有限公司;肝/肌糖原測定試劑盒、乳酸(LD)測定試劑盒、尿素氮(BUN)測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒和丙二醛(MDA)測定試劑盒均購于江蘇南京建成生物工程研究所;6周齡左右雄性昆明小鼠120只由廣西醫科大學實驗動物中心提供,許可證號為SCXK桂2014-0002。

UV-2102PC型紫外分光光度計尤尼柯(上海)儀器有限公司;HH.S11-8型水浴鍋上海博訊實業有限公司醫療設備廠;CR22G型高速冷凍離心機日本日立公司;Alphal-4型冷凍干燥機德國Christ公司;BL-620S型精密電子天平日本島津公司。

1.2實驗方法

1.2.1牡蠣酶解物干粉的制備取新鮮牡蠣肉,洗凈、瀝干、勻漿,按1∶3料水比加入蒸餾水,調至pH7.0,加入動物蛋白水解酶量為1000 U/g肉,于53 ℃恒溫水浴鍋中放置6 h,取出后在1500 r/min條件下離心20 min,取上清液,冷凍干燥成干粉保存[11]。

1.2.2實驗動物分組灌胃刺五加提取物的劑量參考徐峰對刺五加提取物的抗疲勞研究設定,選擇0.7 g/(kg·d)作為中劑量組。參考張部昌對受試物劑量的設定,將與牡蠣蛋白酶解物復合的低劑量刺五加、中劑量刺五加和高劑量刺五加的劑量設定比例為1∶5∶15[12]。

將昆明小白鼠隨機分為以下6組并進行灌胃處理。其中,陰性對照組灌胃蒸餾水、牡蠣蛋白酶解物組以1.3 g/(kg·d)進行灌胃、低劑量刺五加提取物與牡蠣蛋白酶解物復合組(LA+牡蠣蛋白酶解物組)以(0.14 g刺五加提取物+1.3 g牡蠣干粉)/(kg·d)進行灌胃、中劑量刺五加提取物與牡蠣蛋白酶解物復合組(MA+牡蠣蛋白酶解物組)以(0.7 g刺五加提取物+1.3 g牡蠣干粉)/(kg·d)進行灌胃、高劑量刺五加提取物與牡蠣蛋白酶解物復合組(HA+牡蠣蛋白酶解物組)以(2.1 g刺五加提取物+1.3 g牡蠣干粉)/(kg·d)進行灌胃、刺五加提取組以0.7 g刺五加提取物/(kg·d)進行灌胃。每只小鼠灌胃體積量為0.01 mL/g,每日上午10點左右灌胃,連續給予受試物4周,實驗期間小鼠自由攝取水和食物。

1.2.3游泳實驗疲勞的最主要表現是運動耐力的下降,運動耐力是反映機體疲勞最直接、最客觀的指標。關于運動耐力的測定方法有運動跑臺、爬桿和游泳。其中,游泳實驗裝置簡單,且實驗結果能客觀地反映機體的體能。測定小鼠的力竭游泳時間是可以直接反映小鼠的抗疲勞能力的運動指標。

參考何來英等人建立的評價保健食品抗疲勞作用的實驗方法,采用負重游泳的方法進行實驗。經口連續給予受試物4周,于末次給樣30 min后,在小鼠尾根部負小鼠體重5%的鉛皮,放入水溫為25 ℃的水箱中,自小鼠入水時開始計時,至小鼠力竭頭部沉入水中5 s未能浮出水面時結束計時,該時間為小鼠的力竭游泳時間[13]。

1.2.4肝糖原含量的測定體內能源主要包括血糖、糖原、磷酸肌酸(CP)和三磷酸腺苷(ATP)等高能磷酸物,長時間劇烈運動時,伴隨著血糖濃度降低,肌糖原、肝糖原以及血液游離脂肪酸逐步被分解利用,當血糖濃度不能維持運動需要時,疲勞就會發生。肝糖原作為能源儲備物質,其含量是抗疲勞的一項生化指標[12]。

與1.2.3使用同期不同批小鼠,于末次給樣30 min后,將小鼠放入水溫為30 ℃的水箱中強制不負重游泳90 min后,將小鼠取出后處死取肝。按照肌/肝糖原試劑盒說明書測定肝糖原的含量。小鼠在水箱游泳期間,應避免小鼠間相互踩踏,造成嗆水現象[13]。

表1　灌胃期間不同組間小鼠體重的變化Table 1　The change of mice weight during the period of intragastric administration

1.2.5血清尿素氮的測定血清尿素氮是在機體氧化供能不足的時候,蛋白質與氨基酸分解代謝的產物,隨著運動負荷的增加而增加。機體內蛋白質氧化供能程度越高,血清尿素氮含量就越高,機體對運動適應性越差,越容易疲勞。

與1.2.4使用同一批小鼠,于末次給樣30 min后,將小鼠放入水溫為30 ℃的水箱中強制不負重游泳90 min后,將小鼠取出,用紗布擦干其眼睛周圍的水,用眼科手術鑷拔眼球取血約0.5 mL。將取出的血放入4 ℃環境,避免劇烈晃動,過夜取血清,按照血清尿素氮試劑盒說明書測定血清尿素氮的含量[13]。

1.2.6血乳酸的測定乳酸是機體在缺氧的情況下,糖酵解的產物,肌肉中pH下降。乳酸在體內的累積能夠導致機體疲勞。乳酸的產生或者加快乳酸的消除,都可以延緩疲勞的產生或者加速疲勞的消除。因此,血乳酸水平可以反映有氧代謝能力、疲勞的產生和消除速度[14]。

與1.2.5取一批血樣,取部分新鮮血樣加入抗凝劑混勻。按照血乳酸試劑盒說明書測定血乳酸的含量[13]。

1.2.7陽性標準的判定與陰性對照組相比,游泳時間、肝糖原含量增加則為陽性,血清尿素氮、血乳酸減少則為陽性。反之則為陰性[13]。

2　結果與分析

2.1不同處理組對小鼠體重變化的影響

對不同處理組的小鼠進行給藥灌胃4周處理,分別在灌胃后的第0、7、14、21和28 d稱量小鼠體重,實驗結果如表1所示。由表1可知,在4周的灌胃期間內,所有小組的小鼠體重均以正常的速度進行自然增長,而且,不同組別的小鼠體重并沒有出現顯著性差異。

2.2不同處理組對小鼠體內抗疲勞指標的影響

2.2.1不同處理組對小鼠力竭游泳時間的影響不同處理組對小鼠力竭游泳時間的影響如表2所示。由表2可知,牡蠣蛋白酶解物組中小鼠的力竭游泳時間為(1205±244) s,相比陰性對照組而言,游泳時間有明顯的延長(p<0.05)。在添加刺五加提取物后,發現低、中劑量的刺五加提取物與牡蠣蛋白酶解物復合組的力竭游泳時間均要長于陰性對照組(p<0.01)。表明低、中劑量刺五加提取物與牡蠣蛋白酶解物復合組及牡蠣蛋白酶解物組能夠增強小鼠的耐力。而且中劑量刺五加提取物與牡蠣蛋白酶解物復合組在延長小鼠游泳時間方面效果較好。表2中刺五加提取物組也表現出較強的耐力,游泳時間較陰性對照組極顯著延長(p<0.01)。這表明中劑量刺五加提取物與牡蠣蛋白酶解物復合組中刺五加成分起到了關鍵作用。刺五加甙與具有人參皂甙相似的適應原樣作用,這種作用能增強機體對疲勞、疼痛、缺氧等有害刺激的非特異性抵抗力[16-17]。這與曲中原關于刺五加總苷抗疲勞實驗研究中得到的結果一致[18]。本實驗也正驗證了刺五加甙對于提高機體抗疲勞的有效性。

表2　不同處理組對小鼠力竭游泳時間的影響Table 2　Effect of different treatment groups on exhausting time of mice swimming

注:*表示與陰性對照組相比,差異顯著(p<0.05);**表示與陰性對照組相比,差異極顯著(p<0.01);表3～表5同。

2.2.2不同處理組對小鼠肝糖原含量的影響不同處理組對小鼠肝糖原含量的影響如表3所示。由表3可知,與陰性對照組相比,實驗組的儲存糖原的能力均有所增加。其中,牡蠣蛋白酶解物組中小鼠的肝糖原含量為(2.68±0.40)mg/g組織,相比陰性對照組而言,體內糖原含量顯著增加(p<0.05)。在添加刺五加提取物后,發現中劑量刺五加提取物與牡蠣蛋白酶解物復合組的肝糖原含量最高,相比陰性對照組含量有明顯的增長(p<0.01)。由表3可知在小鼠肝糖原儲存能力方面,刺五加提取物組表現并不突出,與牡蠣蛋白酶解物組相關的實驗組均表現出較好的肝糖原儲存能力。這可能與牡蠣中的糖原物質有關。張騫對牡蠣糖原的抗疲勞活性研究發現,牡蠣糖原能夠顯著增加肝糖原的儲備含量,為機體提供更多的能量來達到抗疲勞的目的[2]。

表3　不同處理組對小鼠肝糖原含量的影響Table 3　Effect of different treatment groups on liver glycogen content of mice

2.2.3不同處理組對小鼠血清尿素氮含量的影響不同處理組對小鼠尿素氮含量的影響如表4所示。由表4可知,與陰性對照組相比,所有實驗組中小鼠尿素氮含量均有降低。其中,牡蠣蛋白酶解物組中小鼠尿素氮含量為(12.16±1.04) mmol/L,與陰性對照組并無顯著性差異。在添加刺五加提取物后,發現中、高劑量刺五加提取物與牡蠣蛋白酶解物復合組的尿素氮含量均極顯著降低(p<0.01),分別為(10.76±1.57) mmol/L和(10.40±1.29) mmol/L。刺五加提取物組的尿素氮含量為(11.09±1.21) mmol/L,相比陰性對照組也有顯著降低現象(p<0.05)。這與曲中原對刺五加總苷抗疲勞實驗研究中,得到的小鼠游泳后血清尿素氮含量結果趨勢一致[18]。也有研究發現,刺五加中富含的天然生物活性物質可以抑制機體腎上腺皮質酮分泌,減緩蛋白質的分解,從而達到抵抗疲勞的目的[19]。

表4　不同處理組對小鼠血清尿素氮含量的影響Table 4　Effect of different treatment groups on serum urea nitrogen content of mice

2.2.4不同處理組對小鼠乳酸含量的影響由表5中的血乳酸含量可知,不負重游泳90 min后,牡蠣蛋白酶解物組體內乳酸水平為(16.86±1.15) mmol/L,相比陰性對照組相比極顯著降低(p<0.01)。而刺五加提取物體內乳酸水平為(18.34±0.59) mmol/L,與陰性對照組并無顯著性差異。在添加刺五加提取物后,低、中劑量刺五加提取物與牡蠣蛋白酶解物復合組與陰性對照組相比具有極顯著性差異(p<0.01),而與牡蠣蛋白酶解物組相比不具有顯著性差異。王勇通過研究牡蠣提取液對小鼠運動耐力及骨骼肌自由基、能量代謝酶的影響發現,牡蠣提取液能夠顯著提高小鼠骨骼肌組織中的乳酸脫氫酶(LDH)活性(p<0.05)[20]。LDH是乳酸功能系統中的一種重要酶,它能催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應[21]。因此可以判斷在抑制或消除乳酸水平能力上,牡蠣蛋白酶解物起關鍵作用。

表5　不同處理組對小鼠乳酸含量的影響Table 5　Effect of different treatment groups on blood lactic acid content of mice

3　結論

通過測定小鼠的力竭游泳時間、肝糖原含量、血清尿素氮(BUN)含量和乳酸(LD)含量四個指標來評價刺五加提取物強化牡蠣蛋白酶解物抗疲勞的效果。牡蠣蛋白酶解物組的一項運動指標(即小鼠力竭游泳時間)顯示陽性且p<0.05,兩項生化指標(即肝糖原含量和血乳酸含量)均為陽性且顯著性分別為p<0.01和p<0.05,這表明牡蠣蛋白酶解物組具有抗疲勞效果。而在牡蠣蛋白酶解物中添加刺五加提取物之后,中劑量的刺五加提取物(0.70 g/kg)表現出更好的抗疲勞效果,一項運動指標(即小鼠力竭游泳時間)以及三項生化指標(肝糖原含量、血清尿素氮含量和血乳酸含量)均顯示陽性且顯著性均為p<0.01。由此可以判斷,添加中劑量的刺五加提取物(0.70 g/kg)確實能夠強化牡蠣蛋白酶解物的抗疲勞效果。

而添加低劑量(0.14 g/kg)和高劑量的刺五加提取物(2.10 g/kg)兩組的抗疲勞效果并沒有比牡蠣蛋白酶解物組好。因此添加刺五加提取物而增強牡蠣蛋白酶解物抗疲勞效果,并不是刺五加成分和牡蠣酶解物成分抗疲勞效果的簡單加乘作用,有可能是刺五加與牡蠣中的成分相互協同作用的最終結果。

[1]吳偉銓. 疲勞駕駛的危害和預防[J]. 科技展望,2015,25(35):233.

[2]陳騫. 牡蠣糖原的提取與抗疲勞活性研究[D]. 無錫:江南大學,2005.

[3]季曉. 復方刺五加抗疲勞作用研究及成分分析[D]. 上海:第二軍醫大學,2014.

[4]林海生,曹文紅,盧虹玉,等. 牡蠣酶解產物改善小鼠學習記憶能力的初步研究[J]. 食品工業科技,2012(19):341-345.

[5]趙秀玲. 牡蠣的生物活性及其食品的開發研究進展[J]. 江蘇調味副食品,2009,26(4):37-41.

[6]吉宏武,苗建銀,邵海艷,等. 近江牡蠣肉水解物的營養成分及抗疲勞作用研究[J]. 食品科技,2010(2):70-73.

[7]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M].北京:中藥醫藥科技出版社,2015.

[8]王浴生. 中藥藥理與應用[M]. 北京:人民衛生出版社,1983.

[9]戎愛群,金吉中,郜葉紅. 復方刺五加抗疲勞作用的實驗研究[J]. 西部中醫藥,2006,19(11):42.

[10]路子佳,盧雪瑤,謝瑤. 西洋參刺五加中藥保健膠囊抗疲勞作用評價[J]. 食品研究與開發,2015(19):167-170.

[11]尤久勇. 牡蠣蛋白飲料色澤變化及其控制技術研究[D]. 湛江:廣東海洋大學,2011.

[12]張部昌,商桂春,袁大鵬,等. 牡蠣口服液抗疲勞作用的研究[J]. 安徽大學學報:自然科學版,1999,23(1):103-106.

[13]何來英,嚴衛星,樓密密,等. 保健食品抗疲勞作用實驗方法研究[J]. 中國食品衛生雜志,1997(4):3-8.

[14]郝更新. 褶牡蠣(Crassostrea plicatula Gmelin)酶解產物抗疲勞活性的研究[D]. 北京：中國科學院大學,2013.

[15]付樂,張蘊琨. L-肉堿及運動對超重小鼠心肌H-FABP和PPARα的影響[C]//2014年中國運動生理生化學術會議論文集,2014.

[16]Farnsworth N R,Kinghorn A D,Soejarto D D,et al. Siberian ginseng(Eleutherococcussenticosus):current status as an adaptogen[J]. Economic & Medicinal Plant Research,1985:155-215.

[17]肖培根.人參、刺五加及其他具有適應原樣作用的藥物[J].醫學參考資料,1972(7):172-174.

[18]曲中原. 刺五加總苷抗疲勞實驗研究[J]. 中成藥,2009,31(3):474-476.

[19]Guan S,Ma J,Chu X,et al. Effects of Total Flavones from Acanthopanax senticosus on L-type Calcium Channels,Calcium Transient and Contractility in Rat Ventricular Myocytes[J]. Phytotherapy Research,2015,29(4):533-539.

[20]王勇,袁強,華巖. 牡蠣提取液對小鼠運動耐力及骨骼肌自由基、能量代謝酶的影響[J]. 現代預防醫學,2013,40(1):106-107.

[21]Sridharan R,Sade R S,Townsley F M,et al. Mechanistic differences in the transcriptional activation of p53 by 14-3-3 isoforms[J]. Nucleic Acids Research,2009,38(3):893-906.

Effect ofAcanthopanaxextracts strengthen the anti-fatigue ability of hydrolysates from oyster

CHANG Ge,QIN Xiao-ming*,ZHANG Chao-hua,CHEN Jian-ping

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing(Zhanjiang),College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

This study was to addAcanthopanaxextracts into protein hydrolysates from oyster to strengthen the anti-fatigue ability of protein hydrolysates from oyster,when it could be estimated by exhaustive swimming in mice. These experimental mice were randomly divided into six groups:negative control group,protein hydrolysates from oyster group(HO,for short),low-doseAcanthopanaxextracts(0.14 g/kg)combined with protein hydrolysates from oyster(LA+HO,for short)group,middle-doseAcanthopanaxextracts(0.70 g/kg)combined with protein hydrolysates from oyster(MA+HO,for short)group,high-doseAcanthopanaxextracts(2.10 g/kg)combined with protein hydrolysates from oyster(HA+HO,for short)group andAcanthopanaxextracts group. Then,drugs were chronically administered to the mice for 4 weeks. To confirm the anti-fatigue effect of these groups,the exhausting time of mice swimming,liver glycogen content,serum urea nitrogen content and blood lactic acid content of mice were measured. The results showed that two biochemical indexes and one sport index of HO were positive,indicated that HO was antti-fatigue. While addAcanthopanaxextracts into HO,three biochemical indexes and one sport index of MA+HO were positive,it showed that MA+HO had the stronger ability of anti-fatigue. It concluded that middle-doseAcanthopanaxextracts could improve the anti-fatigue activity of protein hydrolysates from oyster,and the results would highly benefit the research and development of effective anti-fatigue healthy foods in the near future.

protein hydrolysates from oyster;Acanthopanaxextract;exhaustive swimming in mice;anti-fatigue ability

2016-01-25

常格(1990-)，女，在讀碩士研究生，主要從事水產品高值化利用方面的研究，E-mail：13058383213@163.com。

秦小明(1964-)，男，博士，教授，主要從事海洋生物資源高值化利用方面的研究，E-mail：xiaoming0502@21cn.com。

現代農業技術體系建設專項資金資助(CARS-48-07B)；廣東省科技廳(2010B020201014)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)14-0334-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.058