鱈魚蛋白酶解肽不同分子量組分抗炎活性的比較研究

唐季清,郭珊珊,羅永康,景　浩,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083;2.山東濱州萬嘉生物科技有限公司,山東濱州 256600)

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鱈魚蛋白酶解肽不同分子量組分抗炎活性的比較研究

唐季清1,郭珊珊2,羅永康1,景浩1,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083;2.山東濱州萬嘉生物科技有限公司,山東濱州 256600)

本研究比較了鱈魚蛋白酶解肽(Cop protein hydrolytic peptide,CPHP)不同分子量組分對細胞炎癥因子釋放的抑制作用。鱈魚蛋白經復合蛋白酶酶解制備得到鱈魚蛋白酶解肽(CPHP),并進一步超濾得到三個不同分子量組分CPHP1(>5000 u)、CPHP2(<3000 u)和CPHP3(3000～5000 u)。用LPS誘導RAW264.7細胞炎癥因子釋放為模型,分別采用Griess法和ELISA分析NO和TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞炎癥因子的含量。結果表明,CPHP不同分子量組分對LPS(500 μg/mL)所致的RAW264.7細胞生長抑制均有顯著保護作用(p<0.05),其保護作用隨CPHP不同分子量組分的濃度升高而逐漸增強;CPHP和CPHP1的保護作用強于CPHP2和CPHP3。CPHP不同分子量組分對LPS(1 μg/mL)誘導RAW264.7細胞NO、IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子釋放均有顯著的抑制作用(p<0.05),其抑制作用隨CPHP不同分子量組分的濃度升高而逐漸增強;CPHP和CPHP1的抑制作用強于CPHP2和CPHP3。總之,CPHP不同分子量組分對LPS所致的細胞生長抑制均有顯著的保護作用(p<0.05),對LPS誘導的細胞炎癥因子的釋放均有顯著抑制作用(p<0.05);CPHP和CPHP1的細胞保護作用和炎癥因子釋放抑制作用均強于CPHP2和CPHP3的。

鱈魚酶解肽,RAW264.7細胞,炎癥因子

近年來研究發現魚蛋白酶解肽具有較好的生物活性。Liang等[1]將大馬哈魚皮蛋白酶解得到魚皮蛋白酶解肽,通過給大鼠飼喂酶解肽,證實了酶解肽可以有效減少腫瘤大鼠的死亡,并延長腫瘤大鼠的存活時間;Wu等[2]對鯖魚蛋白酶解得到酶解肽,酶解肽的DPPH自由基清除率和還原能力隨著酶解時間的延長而逐漸升高;且酶解肽與分離純化得到的較小分子量多肽相比,具有較強的抗氧化活性。

目前已有一些關于魚蛋白酶解肽抗炎活性的報道。Sung等[3]報告用胰蛋白酶和α-凝乳蛋白酶酶解香魚蛋白制備得到酶解肽對LPS誘導RAW264.7細胞NO以及TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放具有抑制作用。Ahn等[4]采用胃蛋白酶酶解三文魚胸鰭蛋白制備得到酶解肽及其1000～2000 u組分,后者對LPS誘導的RAW264.7細胞NO以及TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子釋放的抑制作用強于前者。Cheng等[5]采用堿性蛋白酶酶解金槍魚蛋白制備得到酶解肽,并分離純化得到兩條十一肽(1543.8 u和1211.5 u),結果顯示兩條十一肽對LPS誘導RAW264.7細胞TNF-α、IL-2、IFN-γ等炎癥因子釋放的抑制作用均強于酶解肽的。

鱈魚是一種主要分布于北太平洋和北大西洋兩側寒冷地帶的海洋經濟魚類[6]。鱈魚蛋白經胰蛋白酶酶解制得的酶解肽具有促進脾淋巴細胞增殖的作用[7];經風味蛋白酶酶解制得的酶解肽具有較好的抗氧化活性[8]。王珊珊等[9]從鱈魚骨肉經胰蛋白酶酶解得到的骨膠原酶解肽中分離純化得到兩個組分BCH1(2000～6000 u)和BCH2(<2000 u)。BCH1和BCH2均可促進成骨細胞的增殖與分化,其中BCH2的作用高于BCH1的。目前有關鱈魚酶解肽抗炎活性的研究未見報道,而且鱈魚酶解肽不同分子量組分的抗炎活性還有待比較確定。

為了研究比較鱈魚蛋白酶解肽不同分子量組分對細胞炎癥因子釋放的抑制活性,本研究采用復合蛋白酶酶解鱈魚蛋白制備得到鱈魚蛋白酶解肽(CPHP),并進一步超濾得到CPHP1(>5000 u)、CPHP2(<3000 u)和CPHP3(3000～5000 u)。用LPS誘導RAW264.7細胞炎癥因子釋放作為模型,采用Griess法和ELISA測定了CPHP不同分子量組分對LPS誘導RAW264.7細胞釋放NO和IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子的抑制作用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

冷凍鱈魚肉山東濱州萬嘉生物科技有限公司;小鼠單核巨噬細胞RAW264.7索萊寶生物科技有限公司;DMEM培養基美國Invitrogen公司;胎牛血清(FBS)北京鼎國生物技術有限責任公司;胰蛋白酶、脂多糖(LPS)、二甲基亞砜(DMSO)美國Sigma公司;NO檢測試劑盒、青霉素/鏈霉素溶液(100×)碧云天生物技術研究所;四甲基偶氮唑藍(MTT)美國Amresco公司;IL-1β、IL-6、TNF-α定量ELISA檢測試劑盒美國Biolegend公司;0.22 μm注射器濾膜美國Millipore公司;溶液配制采用去離子水。

680型酶標儀美國Bio-Rad公司;PHS-3C+型酸度計成都市紀方舟科技有限公司;XB 220A型電子天平德國Precisa Gravimetrics AG公司;R800001236型孔板振蕩美國Biocote公司;MCO-15Acv型細胞培養箱日本Sanyo公司;BSC-1500IIA2-X型生物安全柜中國Biobase公司。

1.2實驗方法

1.2.1鱈魚蛋白酶解肽的制備鱈魚蛋白酶解及分離純化過程如下:將冷凍鱈魚魚肉解凍,按料液比1∶1.5向魚肉中加水,95 ℃加熱15 min將內源酶滅活,攪勻后用復合蛋白酶50 ℃酶解4 h。將酶解產物于95 ℃加熱15 min將復合蛋白酶滅活,再經5000×g離心15 min。取其上清,得到酶解肽(CPHP)。將CPHP通過5000 u孔徑的中空纖維超濾膜,得到分子質量>5000 u酶解肽組分(CPHP1)以及<5000 u的酶解肽組分,再將分子量<5000 u的組分通過3000 u孔徑的中空纖維超濾膜,得到分子量<3000 u的酶解肽組分(CPHP2)和3000～5000 u酶解肽組分(CPHP3)。四種不同分子量組分溶液最后經冷凍干燥處理后制成粉末。稱取CPHP不同分子量組分凍干粉末于無菌離心管中,于生物安全柜中,加入無菌PBS(pH=7.4)分別配制成1、2和3 mg/mL的CPHP不同分子量組分溶液。

1.2.2RAW264.7細胞培養RAW264.7細胞在細培養皿(直徑100 mm)內用DMEM10(含10%胎牛血清的DMEM)培養,于37 ℃、5% CO2培養箱。當細胞生長至覆蓋孔底面積的90%時,棄去培養液,向培養皿內倒入約1 mL胰酶消化液(0.01% EDTA,0.25%胰酶),將培養皿放入37 ℃培養箱,放置15 min,向培養皿中加入5～7 mL DMEM10終止消化,用移液管反復吹打,顯微鏡下觀察直至形成單顆細胞懸液,接種于培養皿。每2～3 d傳代一次。

1.2.3細胞生長抑制的測定將RAW264.7細胞以1×105個/mL密度100 μL接種于96孔板,于37 ℃、5% CO2培養箱中培養12 h后,棄培養基,加入100 μL不同終濃度的CPHP不同分子量組分溶液(0、1、2和3 mg/mL),于CO2培養箱中培養3 h后,棄上清,加入50 μL含LPS的培養基,于CO2培養箱中繼續培養24 h。培養結束后,棄培養基,加入70 μL含0.5 mg/mL MTT的DMEM,繼續培養4 h后,小心棄去上清,加入70 μL含0.04 N HCl的異丙醇溶液,震蕩5 min,在490 nm波長處檢測吸光值。以對照組為100%,計算細胞生長抑制百分率。

1.2.4細胞炎癥因子的測定將RAW264.7細胞以1×105個/mL密度1 mL接種于24孔板,于37 ℃、5% CO2培養箱中培養12 h后,棄培養基,加入1 mL不同終濃度的CPHP不同分子量組分溶液(0、1、2和3 mg/mL),于CO2培養箱中培養3 h后,棄上清,加入500 μL含LPS的培養基,于CO2培養箱中繼續培養24 h。每孔吸取200 μL培養液于1.5 mL離心管作為樣品。采用NO檢測試劑盒檢測樣品中NO的濃度,具體操作按照試劑盒說明書進行。簡述如下,將NaNO2標準品濃度稀釋至1～100 μmol/L(0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L)。取96孔板,每孔依次加入50 μL標準品或樣品、50 μL Griess Reagent I和50 μL Griess Reagent II,避光放置5 min,在540 nm波長處檢測吸光值。根據NaNO2濃度和吸光值標準曲線,計算樣品中NO含量。分別采用IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA試劑盒檢測樣品中IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度,具體操作按照試劑盒說明書進行。在450 nm波長處檢測吸光值。根據IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度和吸光值標準曲線,計算樣品中對應炎癥因子的含量。

1.2.5統計學分析所有實驗均重復3次,數據結果以平均值±標準差(Mean±SD)表示。單因素方差分析采用Minitab17.1.0軟件的one way ANOVA程序進行分析。均數間比較利用Turkey檢驗分析,顯著性水平設定為p<0.05。

表1　CPHP不同分子量組分對RAW264.7細胞生長的影響Table 1　Effects of CPHP fractions on RAW264.7 cell growth

表2　CPHP不同分子量組分對LPS所致的RAW264.7細胞生長抑制的影響Table 2　Effects of CPHP fractions on LPS-induced RAW264.7 cell growth inhibition

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);同行不同大寫字母表示差異顯著(p<0.05);表3～表6同。

2　結果與分析

2.1CPHP不同分子量組分對LPS所致的RAW264.7細胞生長抑制的保護作用

2.1.1LPS和CPHP不同分子量組分對RAW264.7細胞生長的影響LPS在1～100 μg/mL時對RAW264.7細胞生長無顯著影響(p>0.05);在200 μg/mL時,LPS對RAW264.7細胞生長開始有顯著抑制作用(p<0.05);在200～1000 μg/mL時,隨著濃度的升高,LPS導致RAW264.7細胞生長的抑制作用逐漸增強(圖1)。因為濃度為500 μg/mL時LPS對RAW264.7細胞生長的抑制作用為50%左右,所以采用500 μg/mL作為致細胞生長抑制的LPS作用濃度。

圖1　LPS對RAW264.7細胞生長的影響Fig.1　Effects of LPS on RAW264.7 cell growth 注:a～d不同字母表示各組平均值之間 具有顯著差異(p<0.05)。

由表1可知，CPHP不同分子量組分各濃度下(1、2和3 mg/mL)對RAW264.7細胞生長均無顯著影響(p>0.05)。

2.1.2CPHP不同分子量組分對LPS所致的RAW264.7細胞生長抑制的保護作用由表2可知，LPS在500 μg/mL時對RAW264.7細胞生長具有顯著的抑制作用(p<0.05)。CPHP不同分子量組分對LPS導致的RAW264.7生長抑制均有顯著的保護作用(p<0.05)。隨著CPHP不同分子量組分的濃度升高(1→2→3 mg/mL),其對LPS導致的RAW264.7細胞生長抑制的保護作用逐漸增強。對CPHP不同分子量組分的保護作用的比較表明,CPHP和CPHP1的強于CPHP2和CPHP3的,CPHP2與CPHP3無顯著性差異(p>0.05);在1 mg/mL時,CPHP與CPHP1無顯著差異(p>0.05);在2、3 mg/mL時,CPHP1的強于CPHP的。總之,CPHP不同分子量組分對LPS所致的細胞損傷均具有較好的保護作用,CPHP和CPHP1的保護作用強于CPHP2和CPHP3。

2.2CPHP不同分子量組分對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子釋放的影響

2.2.1CPHP不同分子量組分對LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放的影響由表3可知，LPS誘導RAW264.7細胞NO釋放顯著升高(p<0.05)。CPHP不同分子量組分對LPS誘導NO釋放均有顯著的抑制作用(p<0.05)。隨著CPHP不同分子量組分的濃度升高(1→2→3 mg/mL),其對LPS誘導NO釋放的抑制作用逐漸增強。對CPHP不同分子量組分的抑制作用的比較表明,CPHP和CPHP1的強于CPHP2和CPHP3的,CPHP1的強于CPHP的;在1、2 mg/mL時,CPHP2與CPHP3無顯著差異(p>0.05);在3 mg/mL時,CPHP3的強于CPHP2的(p<0.05)。總之,CPHP不同分子量組分對LPS誘導的NO釋放均有較好的抑制作用,CPHP和CPHP1的抑制作用強于CPHP2和CPHP3的。

表3　CPHP不同分子量組分對LPS誘導RAW264.7細胞NO釋放的影響Table 3　Effects of CPHP fractions on LPS-induced NO release of RAW264.7 cells

表4　CPHP不同分子量組分對LPS誘導RAW264.7細胞IL-1β釋放的影響Table 4　Effects of CPHP fractions on LPS-induced IL-1β release of RAW264.7 cells

表5　CPHP不同分子量組分對LPS誘導RAW264.7細胞IL-6釋放的影響Table 5　Effects of CPHP fractions on LPS-induced IL-6 release of RAW264.7 cells

2.2.2CPHP不同分子量組分對LPS誘導的RAW264.7細胞IL-1β釋放的影響由表4可知，LPS誘導RAW264.7細胞IL-1β釋放顯著升高(p<0.05)。CPHP不同分子量組分對LPS誘導RAW264.7細胞IL-1β釋放均有顯著的抑制作用(p<0.05)。隨著CPHP不同分子量組分的濃度升高(1→2→3 mg/mL),其對LPS誘導IL-1β釋放的抑制作用逐漸增強。對CPHP不同分子量組分的抑制作用的比較表明,CPHP和CPHP1的強于CPHP2和CPHP3的,CPHP1的強于CPHP的;在1、2 mg/mL時,CPHP2與CPHP3無顯著差異(p>0.05);在3 mg/mL時,CPHP3的強于CPHP2的。總之,CPHP不同分子量組分對LPS誘導的IL-1β釋放均有較好的抑制作用,CPHP和CPHP1的抑制作用強于CPHP2和CPHP3的。

2.2.3CPHP不同分子量組分對LPS誘導的RAW264.7細胞IL-6釋放的影響由表5可知，LPS誘導RAW264.7細胞IL-6釋放顯著升高(p<0.05)。CPHP不同分子量組分對LPS誘導RAW264.7細胞IL-6釋放均有顯著的抑制作用(p<0.05)。隨著CPHP不同分子量組分的濃度升高(1→2→3 mg/mL),其對LPS誘導IL-6釋放的抑制作用逐漸增強。對CPHP不同分子量組分的抑制作用的比較表明,CPHP和CPHP1的強于CPHP2和CPHP3的,CPHP1的強于CPHP的;在1、2 mg/mL時,CPHP2與CPHP3無顯著差異(p>0.05);在3 mg/mL時,CPHP3的強于CPHP2的。總之,CPHP不同分子量組分對LPS誘導的IL-6釋放均有較好的抑制作用,CPHP和CPHP1的抑制作用強于CPHP2和CPHP3的。

2.2.4CPHP不同分子量組分對LPS誘導的RAW264.7細胞TNF-α釋放的影響由表6可知，LPS誘導RAW264.7細胞TNF-α釋放顯著升高(p<0.05)。CPHP不同分子量組分對LPS誘導RAW264.7細胞TNF-α釋放均有顯著的抑制作用(p<0.05)。隨著CPHP不同分子量組分的濃度升高(1→2→3 mg/mL),其對LPS誘導TNF-α釋放的抑制作用逐漸增強。對CPHP不同分子量組分的抑制作用的比較表明,CPHP和CPHP1的強于CPHP2和CPHP3的,CPHP1的強于CPHP的;在1、2 mg/mL時,CPHP2與CPHP3無顯著差異(p>0.05);在3 mg/mL時,CPHP3的強于CPHP2的。因此,CPHP不同分子量組分對LPS誘導的TNF-α釋放均有較好的抑制作用,CPHP和CPHP1的抑制作用強于CPHP2和CPHP3的。

表6　CPHP不同分子量組分對LPS誘導RAW264.7細胞TNF-α釋放的影響Table 6　Effects of CPHP fractions on LPS-induced TNF-α release of RAW264.7 cells

3　討論

LPS等炎性刺激因子可以與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)結合,激活髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor88,MyD88)信號通路,最終激活核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB),導致誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOs)、TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2(PGE2)等炎癥因子的轉錄和釋放[10]。NO由iNOS催化生成,可進一步生成RNS(Reactive nitrogen species)導致細胞的氧化損傷[11]。TNF-α有腫瘤細胞殺傷作用[12],可使血管內皮細胞通透性增加,趨化炎性細胞,還可通過激活NF-κB通路促使其他細胞因子的合成和釋放[13]。IL-1β能促使細胞粘附因子的合成和釋放,加速單核細胞與內皮細胞的粘附[14]。IL-6促進T細胞、B細胞以及NK細胞的增殖分化[15]。這些細胞因子在細胞炎性反應和慢性病的發病機理中起著重要作用。

Gayle等[16]報告LPS在80 μg/mL時作用72 h會引起胚胎鼠腦神經膠質細胞釋放NO、TNF-α和IL-1β等炎癥因子,并導致神經膠質細胞生長抑制。Campo等[17]報告LPS在50 μg/mL時作用24 h可抑制軟骨細胞生長率至75%,加入1 mg/mL硫酸軟骨素可使細胞生長率保持在95%。本實驗中,LPS在500(g/mL時作用24 h可抑制RAW264.7細胞生長率至50%。CPHP不同分子量組分在1 mg/mL時,可使RAW264.7細胞生長率保持在54%～58%。

Ahn等[4]報道了三文魚酶解肽對LPS誘導RAW264.7細胞NO、TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子釋放具有抑制作用,其中1000～2000 u組分的抑制作用強于酶解肽的。De Mejia等[18]報告大豆多肽對LPS誘導的RAW264.7細胞NO、IL-1β、IL-6等炎癥因子的釋放有較好的抑制作用,其中5 ku多肽的抑制作用強于8、14 ku多肽的。這些結果表明酶解肽低分子量組分對炎癥因子釋放的抑制作用均強于高分子量組分的。然而Park等[19]報道了紫殼菜蛤蛋白酶解肽對LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放具有抑制作用,且>5 ku組分的抑制作用明顯強于1～5 ku組分的。本研究中CPHP高分子量組分的抑制作用強于低分子量組分的。這與Park等的研究結果一致。Wu等[2]對鯖魚蛋白酶解分離純化得到1400、900和200 u三條多肽,通過抗氧化實驗證實了1400 u的多肽相較于900 u和200 u的多肽具有更高的DPPH自由基清除率。這個報告也與本研究結果一致,酶解肽高分子量組分的生物活性強于低分子量組分的。

4　結論

CPHP不同分子量組分對LPS所致的RAW264.7細胞生長抑制均有保護作用,對LPS誘導RAW264.7細胞的炎癥因子(NO、IL-1β、IL-6和TNF-α)釋放均有抑制作用。CPHP和CPHP1對細胞生長的保護作用和對炎癥因子釋放的抑制作用均強于CPHP2和CPHP3。

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Comparison of anti-inflammatory activity of four different molecular fractions of cod protein hydrolytic peptides

TANG Ji-qing1,GUO Shan-shan2,LUO Yong-kang1,JING Hao1,*

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.Shandong Wanjia Biological Science and Technology Co.,Ltd.,Binzhou 256600,China)

Effects of four different molecular fractions of cod protein hydrolytic peptides(CPHP)on LPS-induced release of inflammatory cytokines were compared. CPHP was a whole mixture of cod protein hydrolytic peptides hydrolyzed by complex protease. The peptides were further fractionated by ultrafiltration into three fractions of CPHP1(>5000 u),CPHP2(<3000 u)and CPHP3(3000～5000 u). Griess assay and ELISA kits were used to measure the levels of NO and inflammatory cytokines(TNF-α,IL-1βand IL-6),respectively. The results showed that the all CPHP fractions protected RAW264.7 cells from LPS(500 μg/mL)induced cell growth inhibition,in a dose dependent manner,and protective effects of CPHP and CPHP1 were higher than that of CPHP2 and CPHP3. All CPHP fractions inhibited release of NO,IL-1β,IL-6 and TNF-αfrom RAW264.7 cells induced by LPS(1 μg/mL),in a dose dependent manner. The inhibitory effects of CPHP and CPHP1 were higher than that of CPHP2 and CPHP3. In conclusion,all four fractions of CPHP had protective effect against LPS induced cell growth inhibition and release of inflammatory cytokines. The CPHP and CPHP1 had higher activity than that of CPHP2 and CPHP3.

cod protein hydrolytic peptide;RAW264.7 cells;inflammatory cytokines

2016-01-04

唐季清(1989- )，男，博士研究生，研究方向：營養與食品安全，E-mail：qing19890604@sina.cn。

景浩(1957- )，男，教授，主要從事食品營養方面的研究，E-mail：haojing@cau.edu.cn。

TS201.4

A

1002-0306(2016)14-0344-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.060