無痕敲除法構建食品安全級枯草芽孢桿菌無芽孢菌株

張明俐,柳鵬福,史吉平,曾　勇

(1.煙臺大學生命科學學院,山東煙臺 264005;2.中國科學院上海高等研究院,綠色化學工程技術中心,上海 201210)

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無痕敲除法構建食品安全級枯草芽孢桿菌無芽孢菌株

張明俐1,2,柳鵬福2,史吉平2,曾勇1,*

(1.煙臺大學生命科學學院,山東煙臺 264005;2.中國科學院上海高等研究院,綠色化學工程技術中心,上海 201210)

利用同源重組法快速構建枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis168)spo0A基因缺陷型無芽孢菌株B.subtilis168Δspo0A。經PCR及核酸電泳驗證,孢子形成率鑒定和芽孢染色鏡檢,確定最終獲得不產芽孢的B.subtilis168Δspo0A基因缺失突變菌株。基因敲除完成后,菌株基因組不需引入抗性基因或其它任何篩選標記,實現了對spo0A基因的無痕基因敲除。本研究對枯草桿菌的工業化生產及提高相關產品食品質量安全性具有重要意義。

枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis168),無痕基因敲除,無芽孢菌株

近年來,隨著分子生物學和基因工程技術的發展,枯草芽孢桿菌作為基因工程表達系統發展迅速。2011年Wang等[1]通過對枯草芽孢桿菌的代謝途徑的改造進行了維生素B2的生產;2013年Phan等[2]通過構建枯草芽孢桿菌基因工程菌使得異源蛋白在枯草芽孢桿菌內大量表達;此外,還有很多應用枯草芽孢桿菌進行核糖生產[3]的報道。

枯草芽孢桿菌的胞外蛋白分泌能力強、生長速率快,發酵周期短以及其公認安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)特性[4]使其成為微生物發酵工業化生產研究熱點。在營養缺乏的條件下,枯草芽孢桿菌會停止生長,產生抗逆性很強的內源性孢子——芽孢。生成芽孢的枯草芽孢桿菌休眠體,對外源基因表達能力大大降低,使枯草芽孢桿菌的工業生產應用受到很大限制[5]。芽孢形成過程的初始階段是由spo0A基因參與調控spo0B,spo0E,spo0F等多個基因的共同表達而啟動的[6]。1998年,Rowe-Magnus等[7]詳細闡述了spo0A基因在芽孢形成過程的作用機制。2004年,余志強等[8]通過同源重組法成功獲得了枯草桿菌spo0A基因缺失突變菌株。但該方法的敲除過程中引入了多余的抗性基因,限制了其在食品工業中的應用。

本研究利用革蘭氏陽性菌的穿梭質粒pMAD[9]構建了spo0A基因敲除載體pMAD-Δspo0A,誘導敲除元件Δspo0A與宿主基因組發生兩次同源重組并取代B.subtilis168基因組上完整的spo0A基因實現了對枯草芽孢桿菌spo0A基因的無痕敲除,并通過分子生物學手段和功能驗證,證實該基因的缺失阻斷了芽孢的形成,達到了預期目的。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株和質粒枯草芽孢桿菌168菌株(B.subtilis168),用于同源重組的出發菌株,購自美國模式菌種收集中心(ATCC 23857);大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α),用做DNA片段克隆與富集,為實驗室保存菌株;pMAD質粒,為革蘭氏陽性菌基因敲除載體,由法國Michel De’barbouille教授惠贈[9];限制性內切酶、T4 DNA連接酶TAKARA公司;KOD PCR Mix及BufferTOYOBO公司;PCR引物合成蘇州金維智公司;枯草桿菌基因組DNA抽提、質粒抽提、DNA片段純化試劑盒Axygen公司。

S1000 PCR儀、MicroPulser電穿孔儀、0.2 cm電轉杯、Gel Dox XR+凝膠成像系統美國BIO-RAD;EPS-300電泳儀、HE-90核酸電泳槽上海天能;ZDP-A2160A電熱培養箱、ZHWY-2110B搖床上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2培養基

LB培養基用于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的培養。

電轉化枯草芽孢桿菌培養基配方:LB培養基,山梨醇0.5 mol/L。

RM培養基(用于菌種復蘇)配方:LB培養基,山梨醇0.5 mol/L,甘露醇0.38 mol/L。

枯草桿菌芽孢誘導培養基配方按甄靜[10]的方法配制。

根據需要在培養基中添加抗生素或X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷),配制時過濾除菌。其中氨芐青霉素(Amp)工作濃度為100 μg/mL,紅霉素(erm)工作濃度為10 μg/mL,用乙醇溶解配制,X-gal工作濃度為50 μg/mL,用二甲基酰胺溶解配制。

1.3實驗方法

1.3.1PCR引物的設計上游同源臂spo0A-up擴增引物a1/s1,下游同源臂spo0A-down擴增引物a2/s2,單交換鑒定引物a3/s4和a4/s3,擴增敲除片段Δspo0A的overlap PCR[11]及雙交換完成鑒定引物a1/s2(引物序列見表1/引物位置見圖1)。

表1　PCR擴增片段引物信息Table 1　Information of PCR amplification segments’ primer

1.3.2PCR方法同源臂片段及基因敲除驗證的PCR擴增體系為:2×KOD Mix 25 μL,上下游引物各1 μL,DNA 1 μL,H2O 22 μL。PCR條件為:預變性94 ℃、5 min,變性94 ℃、30 s,退火52 ℃、30 s,延伸68 ℃、1 min/kb。25個循環。68 ℃延伸10 min,終止。

兩段同源臂片段連接成Δspo0A敲除元件采用重疊延伸PCR(overlap PCR)法拼接到一起,反應體系為:2×KOD Mix 25 μL,上下游引物(a1/s2)各1 μL,上下游同源臂片段DNA各5 μL,H2O 13 μL。PCR條件為:預變性94 ℃、5 min,變性94 ℃、30 s,退火 50 ℃、50 s,延伸68 ℃、3 min,25個循環。68 ℃延伸10 min,結束。

1.3.3敲除載體pMAD-Δspo0A的構建將上述PCR擴增獲得的spo0A基因上下游同源臂的DNA片段用BamHI和EcoRI雙酶切,片段清潔回收后與同樣經過BamHI和EcoRI雙酶切的質粒pMAD連接,轉化到大腸桿菌DH5α進行擴增,得到的重組質粒即為可用于后續基因敲除的載體pMAD-Δspo0A。

1.3.4spo0A基因敲除的操作步驟將敲除載體質粒pMAD-Δspo0A電轉化進枯草芽孢桿菌168菌株,涂布X-gal加紅霉素抗性平板,30 ℃過夜培養。挑取顯藍色轉化子,液體LB培養基中30 ℃過夜培養,按5%接種量轉接至5 mL紅霉素抗性的LB培養基,30 ℃孵育2 h,升溫至42 ℃繼續孵育6 h,稀釋(10-2～10-5)涂布含有X-gal和紅霉素的平板,42 ℃過夜培養。用a3/s4和a4/s3菌落PCR驗證,每個菌都做兩個PCR,擴增時間2 min,電泳選擇能擴出來條帶的即為單交換完成的陽性克隆。挑取陽性單菌落于30 ℃和無抗性LB培養基中孵育6 h,升溫至42 ℃繼續孵育3 h,稀釋(10-2～10-5)涂布含有X-gal的無抗性LB平板,42 ℃過夜培養。挑取顯白斑的單菌落做菌落PCR鑒定,引物用a1/s2,擴增時間3 min,電泳檢測片段大小應為2.4 kb的為陽性克隆。

1.3.5spo0A基因缺陷型菌株的鑒定方法按照Agaisse H等[12]的方法分別對野生型枯草芽孢桿菌與spo0A基因缺陷型菌株進行芽孢形成率檢測和菌體及芽孢染色,鑒定spo0A基因的敲除是否成功阻斷了菌株芽孢的形成。

1.3.6菌種生長曲線的測定將-80 ℃冰箱凍存的菌種接入LB培養基中37 ℃搖床活化培養12 h,將活化后的菌種以1%的量轉接至含有50 mL LB培養基的250 mL搖瓶中,37 ℃,200 r/min恒溫搖床培養,培養時間72 h。每隔8 h取樣,測定吸光值的變化。設置3組平行實驗,采用偏差不大于15%的數據作為有效數據。以培養時間作為橫坐標,相應的吸光值為縱坐標繪制菌種生長曲線。

2　結果與討論

2.1spo0A基因敲除的原理

敲除載體的構建及同源重組發生過程如圖1所示:①,②,③片段分別表示spo0A基因上游1200 bp片段,spo0A基因編碼序列(804 bp),spo0A基因下游1201 bp片段。

(A)以野生型菌株基因組為模板,設計引物a1/s1,a2/s2,PCR分別擴增spo0A基因上下游同源臂。連接兩段同源臂構建成敲除元件Δspo0A。(B)敲除元件插入pMAD質粒構建成完整敲除載體pMAD-Δspo0A。(C)敲除載體進入細菌后,42 ℃溫度誘導下,首先與基因組發生單交換,敲除載體pMAD-Δspo0A可由兩個位點插入B.subtilis168基因組。一次同源重組發生后pMAD-Δspo0A質粒從不同位置整合入菌株基因組,此時菌株攜帶質粒紅霉素抗性,設計引物a3/s4,a4/s3驗證單交換的發生,引物一端位于插入基因組的pMAD質粒序列內部,一端位于原始基因組序列上,長度約為1750 bp。(D)選擇發生單次交換的菌株繼續培養,插入片段發生二次同源重組,B.subtilis168菌株基因組上的pMAD-spo0A片段脫落丟失,形成B.subtilis168Δspo0A菌株。

圖1　重組質粒pMAD-Δspo0A的構建與spo0A基因敲除原理Fig.1　Principle of recombinant plasmid pMAD-Δspo0A construction and spo0A gene knockout

2.2敲除片段的克隆與鑒定

按1.3方法所示的PCR條件與引物在spo0A基因的上下游分別PCR擴增獲得長度為1200 bp左右的同源片段spo0A-up,spo0A-down(圖2)。同源片段清潔回收備用。

圖2　spo0A上下游同源臂的擴增Fig.2　Amplification of spo0A upstream and downstream homologous arm segments 注：1、2：spo0A-up片段； 3、4：spo0A-down片段； 5：Marker。

Overlap PCR拼接同源片段spo0A-up,spo0A-down,PCR條件按1.3所示overlap PCR條件。獲得長度約為2400 bp的Δspo0A長片段(圖3)。

圖3　spo0A敲除元件PCR拼接Fig.3　spo0A knockout module PCR link 注：1:Marker；2、3：敲除元件Δspo0A。

2.3敲除載體的構建與鑒定

分別用限制性內切酶BamHI,EcoRI在37 ℃條件下酶切溫敏型穿梭質粒pMAD約3 h,獲取攜帶兩個酶切位點的線性pMAD質粒,清潔回收該質粒備用。用T4 DNA ligase 16 ℃連接敲除片段Δspo0A與pMAD,獲取完整的敲除載體pMAD-Δspo0A。

2.4spo0A基因敲除

電穿孔轉化法將敲除載體pMAD-Δspo0A導入到菌株B.subtilis168中,30 ℃過夜培養,紅霉素(erm)抗性平板生長的單菌落即為轉入了整合載體的轉化子。

挑取轉化子繼續培養,由于敲除載體存在spo0A基因上下游序列同源序列,可以通過單交換整合于基因組spo0A的上游或下游上,提高培養溫度到42 ℃繼續培養6 h,溫敏型敲除載體丟失,涂布紅霉素抗性和X-gal的平板,能夠生長的藍色菌落為發生了單次交換的突變體。用兩對鑒定引物a3/s4,a4/s3同時對一個單菌落進行PCR驗證單交換的發生,其中一對引物能夠擴增出約1750 bp條帶,另一對引物不能擴增出條帶的為陽性克隆(圖4)。一次重組的突變體在30 ℃無抗生素壓力的條件下繼續培養,無抗環境進一步誘導發生第二次同源重組,繼續在42 ℃培養過夜,質粒序列脫離菌株基因組丟失。經過兩次同源重組,敲除片段Δspo0A交換到枯草芽孢桿菌基因組上替換spo0A基因序列,或者發生回復突變。鑒定引物a1/s2 PCR驗證雙交換的完成,擴增出2400 bp條帶的克隆為spo0A基因敲除成功的菌株,擴增出3200 bp條帶的克隆為發生回復突變的菌株(圖5)。

圖4　單交換PCR驗證Fig.4　Single crossover validation 注：1、5、6：分別在兩個重組位點發生單交換1750 bp； 2、3、4：分別在兩個重組位點未發生單交換；7：Marker。

圖5　spo0A基因敲除成功驗證Fig.5　spo0A knockout over validation 注：1：Marker； 2、3、4：Δspo0A 2400 bp； 5、6、7 ：B.subtilis168未敲spo0A基因3200 bp。

隨著質粒丟失,突變菌株失去紅霉素抗性,在X-gal和無抗LB平板上為白斑菌落。實驗發現平板上白斑菌落有兩種表觀差異明顯的菌落,兩種菌落都具有枯草桿菌基本形態特征:白色,表面粗糙不平滑,邊緣波狀。兩種菌分別經PCR驗證后發現:菌落形態比較規則,透光性差的菌落為野生型菌落(圖6);形狀比較不規則,更加透明的菌落為基因敲除成功克隆(圖7)。

圖6　野生型B. subtilis168在LB平板上的菌落形態Fig.6　The colony characteristics of wild-type B. subtilis168 on LB plating medium

圖7　突變型B. subtilis168Δspo0A在LB平板上的菌落形態Fig.7　The colony characteristics of B. subtilis168Δspo0A on LB plating medium

2.5B.subtilis168Δspo0A與B.subtilis168芽孢形成及生長周期比對

2.5.1野生型B.subtilis168與B.subtilis168Δspo0A孢子形成率按照1.3.5所述芽孢率形成鑒定方法,在80 ℃下加熱10 min基本能夠完全殺死枯草芽孢桿菌營養細胞,而芽孢具有強抗逆性,活力基本不會受到影響。

分別將野生型枯草芽孢桿菌菌株和spo0A缺陷型菌株設置三組平行,使用枯草芽孢桿菌芽孢形成培養基搖床培養24 h后,取樣梯度稀釋,分別取10-6、10-7、10-8三個梯度各100 μL,涂平板,測定菌種濃度;同時將這三組剩余菌液置于80 ℃水浴鍋加熱15 min,殺死營養細胞,涂平板,測定芽孢形成率。37 ℃倒置培養24 h后計算兩組菌種芽孢形成率。

從表2數據可以看出,野生型菌株誘導培養24 h后形成芽孢。敲除spo0A基因可以完全阻斷枯草芽孢桿菌芽孢的形成。

表2　野生型B.subtilis 168與B.subtilis168 Δspo0A菌株芽孢形成率測定Table 2　Sporulation ratio of wild type B.subtilisand 168Δspo0A strains bacillus

2.5.2野生型B.subtilis168與B.subtilis168Δspo0A芽孢染色鏡檢分別將野生型枯草桿菌與spo0A基因缺陷型菌株(B.subtilis168Δspo0A)接入枯草桿菌芽孢形成培養基中37 ℃培養24 h,進行革蘭氏染色,孔雀綠染液加熱染色5 min,番紅復染1 min后鏡檢,經革蘭氏染色后芽孢呈現初染液孔雀綠的綠色,營養細胞呈現番紅復染液的紅色(圖8、圖9)。對比可以看出相同條件下培養24 h后,B.subtilis168Δspo0A視野內沒有芽孢生成,而野生型B.subtilis168生成大量芽孢休眠體。

圖8　B.subtilis168Δspo0A用芽孢形成 培養基培養24 h染色結果(1000×)Fig.8　Stain and microscopic examination result of B.subtilis168 Δspo0A cultured in sporulation medium for 24 h(1000×)

圖9　 野生型B.subtilis168用芽孢 形成培養基24 h染色結果(1000×)Fig.9　Stain and microscopic examination result of Wild type B.subtilis168 cultured in sporulation medium for 24 h(1000×)

2.5.3野生型B.subtilis168與B.subtilis168Δspo0A生長曲線野生型B.subtilis168與B.subtilis168Δspo0A菌種按照1.3.6所述方法進行培養并制作生長曲線(圖10)。可以看出同樣培養條件下,無芽孢B.subtilis168Δspo0A生長規律與野生型B.subtilis168存在明顯差異。野生型B.subtilis168在培養8 h后對數期結束,生長速率減緩,在8～48 h為穩定期,48 h后到達衰亡期。而B.subtilis168Δspo0A菌株在32 h內均保持較快生長速率,最高菌種濃度遠遠超過野生型菌株,但菌種活力對培養條件的變化更加敏感,隨著培養基的逐漸消耗,菌種在32 h后進入衰亡期。

圖10　野生型B. subtilis 168與B. subtilis 168Δspo0A 在LB培養基中的生長曲線Fig.10　Growth curve of wild B. subtilis 168 and B. subtilis 168Δspo0A

3　結論

spo0A基因是控制枯草芽孢桿菌芽孢生成的基因之一,在枯草桿菌穩定期起始開始表達,其表達產物不僅調節著其它芽孢生成相關基因的表達,而且影響著枯草芽孢桿菌穩定期其他相關代謝產物基因的表達。敲除spo0A基因后的枯草芽孢桿菌菌落形態發生了很大改變,菌落變得比較透明,形狀更加不規則。通過對枯草芽孢桿菌芽孢基因spo0A基因的敲除,可以消除菌種生長過程中芽孢的產生,對提高枯草芽孢桿菌工業生產效率有重要意義。

余志強等[6]曾利用同源重組整合法構建spo0A基因缺陷型枯草芽孢桿菌菌株。在該同源重組過程中對枯草芽孢桿菌基因組引入了新霉素抗性基因(neor)作為基因缺陷型菌株篩選標記。該方法獲得的改造菌株含有新霉素抗性,如繼續對該菌株進行基因改造則不能再用新霉素抗性基因作為篩選標記。因此這種同源重組法將對菌株的進一步改造產生局限性,并且攜帶抗生素抗性的菌株引入了多余的抗性基因,其產物作為食品藥品添加成分會存在安全隱患。而本研究獲得的spo0A基因缺陷型枯草芽孢桿菌菌株不需引入抗性基因或其他篩選標記,此類基因敲除過程稱為無痕敲除,對菌種的繼續改造無任何限制,并且不會引起食品藥品安全隱患,是一種可以廣泛應用的基因改造方法。

[1]Wang ZW,Chen T,Ma XH,et al. Enhancement of riboflavin production withBacillussubtilisby expression and site-directed mutagenesis ofzwfandgndgene fromCorynebacteriumglutamicum[J]. Bioresource Technology,2011,102(4):3934-3940.

[2]Phan TTP,Nguyen HD,Schumann W. Construction of a 5′-controllable stabilizing element(CoSE)for over-production of heterologous proteins at high levels inBacillussubtilis[J].J Biotechnology,2013,168(1):32-39.

[3]Wu L,Li Z,Ye Q.Enhanced d-ribose biosynthesis in batch culture of a transketolase-deficientBacillussubtilisstrain by citrate[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2009,36(10):1289-1296.

[4]Schallmey M,Singh A,Ward OP.Developments in the use ofBacillusspecies for industrial production[J].Canadian Journal of Microbiology,2004,50(1):1-17.

[5]沈衛峰,牛寶龍,翁宏飚,等.枯草芽孢桿菌作為外源基因表達系統的研究進展[J].浙江農業學報,2005,17(4):234-238.

[6]劉燕,秦玉昌,潘寶海.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在芽孢形成過程中的幾個關鍵事件[J].生命科學,2005,17(4):360-363.

[7]Rowe-Magnus DA,Spiegelman GB.DNA strand separation during activation of a developmental promoter by the Bacillus subtilis response regulator spo0A[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1998,95(9):5305-5310.

[8]余志強,楊明明,楊朝霞.同源重組法構建枯草桿菌spo0A基因缺失突變株[J].武漢大學學報:理學版,2004,50(2):229-233.

[9]Maryvonnc Arnaud,Arnaud Chastanct,Michel Debarbouille.New vector for efficient allelic replacement in natually nontransformable,low-GC-content,gram-positive bacteria[J].Applied & Environmental Microbiology,2004,70(11):6887-6891.

[10]甄靜,郭直岳,謝寶恩,等.枯草芽孢桿菌XK-1產芽孢條件的優化[J].中國農學通報,2012,28(27):146-151.

[11]畢研,郭廣君,呂素芳,等.基于Overlap PCR方法進行豬偽狂犬病毒TK基因缺失載體的構建、鑒定及生物學分析[J].中國動物檢疫,2011,28(2):40-43.

[12]Agaisse H,Lereclus D.Expression in Bacillus subtilis of the Bacillus thuringiensis CryIIIA toxin gene is not dependent on a sporulation-specific sigma factor and is increased in a spo0A mutant[J].Journal of Bacteriology,1994,176(15):4734-4741.

Construction of a food safe gradeBacillussubtilisnonspore strain with clean deletion

ZHANG Ming-li1,2,LIU Peng-fu2,SHI Ji-ping2,ZENG Yong1,*

(1.College of Life Sciences,Yantai University,Yantai 264005,China;2.Green Chemical Engineering Technology Center,Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Pudong New District,Shanghai 201210,China)

Construction a nonsporeB.subtilis168 strain(B.subtilis168Δspo0A)by deleting thespo0Agene using the method of homologous recombination. The nonsporeB.subtilis168Δspo0Astrain was successfully got through PCR,nucleic acid electrophoresis,sporulation ratio and microscopy identification.The genome of this engineering strain does not need to insert resistance gene or any other selection marker gene afterspo0Agenes’ knockout which called clean deletion. This study is of great significance for industrial production ofB.subtilisas well as improve safety of food and drug.

Bacilussubtilis168;clean deletion;nonspore strain

2016-01-20

張明俐(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物與免疫，E-mail:zml919201949@126.com。

曾勇(1967-)，男，副教授，研究方向：水生動物的病原與免疫機制，E-mail:zy110cn@aliyun.com。

TS201.3

A

1002-0306(2016)14-0175-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.027