使用圓二色性光譜分析二級結(jié)構(gòu)對大豆分離蛋白表面疏水性的影響

王　辰,江連洲

(1.大理大學(xué),云南大理 671003;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué),黑龍江哈爾濱 150030)

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使用圓二色性光譜分析二級結(jié)構(gòu)對大豆分離蛋白表面疏水性的影響

王辰1,江連洲2,*

(1.大理大學(xué),云南大理 671003;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué),黑龍江哈爾濱 150030)

旨在采用圓二色性光譜手段研究二級結(jié)構(gòu)對我國六種經(jīng)常使用的大豆品種制備而成的分離蛋白的表面疏水性的影響。實驗先是對六個品種的大豆進行分離蛋白的提取,并對其性質(zhì)進行測定,包括溶解度和表面疏水性;再對六種大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行測定和分析;通過SPSS軟件對六種大豆分離蛋白的表面疏水性和二級結(jié)構(gòu)的數(shù)值進行線性相關(guān)性分析,探究二者之間的構(gòu)效關(guān)系。研究中發(fā)現(xiàn)六個品種的大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)、溶解性、表面疏水性都差異顯著(p<0.05),表面疏水性的大小隨著α-螺旋含量升高而減小,隨著無規(guī)則卷曲和β-折疊含量增大而提高,因β-轉(zhuǎn)角含量變化的影響不明顯。SPSS線性相關(guān)性分析表明品種間的表面疏水性與β-轉(zhuǎn)角含量線性關(guān)系不顯著,與無規(guī)則卷曲、β-折疊含量呈正向相關(guān),與α-螺旋含量呈負(fù)向相關(guān)。

大豆分離蛋白,表面疏水性,圓二色性光譜

大豆分離蛋白(Soybean Protein Isolate,SPI)是一種蛋白純度在90%以上的功能性食品添加劑或食品原料,它的提取原料是低變性的脫脂豆粕,人們利用堿溶酸沉的原理和現(xiàn)代化的加工手段將其提取而成,其在食品工業(yè)中的生產(chǎn)占有重要的地位[1-4]。溶解性對于蛋白質(zhì)來講是一個極其重要的物理性質(zhì)。疏水作用影響著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),水合性質(zhì)以及其他重要的功能性[5-6]。由于蛋白質(zhì)具有大分子結(jié)構(gòu),分子間的相互作用對蛋白質(zhì)的功能性有著重要的影響,蛋白質(zhì)分子表面的親疏基團決定著表面疏水性[7-8]。蛋白質(zhì)表面疏水性對于蛋白質(zhì)發(fā)揮功能性質(zhì)至關(guān)重要。

華欲飛等[9]等研究了三種不同大豆分離蛋白的凝膠性能,原料差異使得大豆分離蛋白的表面疏水性產(chǎn)生很大的不同,證實了表面疏水性是影響大豆蛋白凝膠性能的重要因素;徐紅華等[10]研究了擠壓膨化處理工藝對大豆粕蛋白質(zhì)表面疏水性影響,研究表明高物料水分、高溫擠壓膨化、低轉(zhuǎn)速時,表面疏水性會提高。目前國內(nèi)針對大豆蛋白表面疏水性的研究,主要集中在兩個方面:一是研究大豆蛋白表面疏水性與其它功能性的關(guān)系,二是研究物理改性[11]、化學(xué)改性[12-13]、生物改性[14-15]對大豆蛋白表面疏水性的影響。對于品種差異與功能性關(guān)系的研究,主要集中在乳化性、凝膠型等功能特性,對于表面疏水性顯見報道。

圓二色性光譜作為一種充分被應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象研究的光譜技術(shù),因其準(zhǔn)確迅速地反映出蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的特點而備受學(xué)者們青睞[16]。因此本實驗采用統(tǒng)一方法實驗室自制大豆分離蛋白,利用遠(yuǎn)紫外區(qū)域圓二色性光譜對六個品種大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行測定,分析品種差異對大豆分離蛋白表面疏水性的影響,爭取更深層次的挖掘SPI的功能特性關(guān)系,解決其在肉制品或飲料等生產(chǎn)過程中的溶解性差和分散性不良等現(xiàn)象,為今后開發(fā)大豆分離蛋白特定產(chǎn)品而進行分子設(shè)計和重組提供重要的理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大豆分離蛋白實驗室自制(原料大豆品種為中黃13,東農(nóng)46,黑農(nóng)46,皖豆34,五星4,冀nf58);Lowry法試劑盒分析純,上海荔達(dá)生物科技有限公司;硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉以上試劑均為分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;鹽酸、硫酸以上試劑均為分析純,北京新光化工試劑廠;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉以上試劑均為分析純,天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)色譜純,Sigma公司。

5430小型高速離心機德國Eppendorf公司;THZ-80型水浴恒溫振蕩器江蘇金壇億通電子有限公司;TU-1800型紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FD5-3型冷凍干燥機美國SIM公司;PHM200型酸度計法國雷迪美特公司;電子分析天平(0.0001 g)北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;PC396型電子秒表深圳市惠波工貿(mào)有限公司;J-810型圓二色譜儀日本JASCO公司。

1.2實驗方法

1.2.1大豆分離蛋白的制備流程參照王辰等[17]的方法。原料大豆經(jīng)去皮、破碎后粉碎過60目篩,然后在40 ℃條件下采用正己烷萃取以制備脫脂豆粕。將脫脂豆粕按1∶15的質(zhì)量比與水混合,用2 mol/L NaOH調(diào)pH至8.0,攪拌1.5 h后,將其懸浮液在4 ℃條件下10000×g離心30 min,取上清液用2 mol/L HCl調(diào)pH至4.5。靜置后在4 ℃條件下6000×g離心30 min,取蛋白沉淀水洗2次,最后取沉淀分散于水中并用2 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0。再在4 ℃條件下10000×g離心30 min,除去少量的不溶物,將其蛋白溶液冷凍干燥后粉碎即得粉末狀大豆分離蛋白。所有步驟均在室溫條件下進行。

1.2.2溶解度和表面疏水性測定參照王辰等[17]的方法。

1.2.3圓二色譜(CD)檢測參照陳勇等[18]的方法。

1.2.4線性相關(guān)性分析采用SPSS V17.0軟件Duncan’s multiple range test方法。

1.3統(tǒng)計分析

2　結(jié)果與討論

2.1大豆分離蛋白的溶解性與表面疏水性

六種大豆分離蛋白的性質(zhì)數(shù)值大小如圖1和圖2所示,品種間的兩種性質(zhì)均存在顯著性差異(p<0.05)。對六種大豆分離蛋白的溶解性和表面疏水性二者數(shù)值進行ANOVA差異顯著性分析,得知二者之間存在非常顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.865,p=0.026)。

圖1　六種品種大豆分離蛋白的溶解度Fig.1 The solubility of six varieties of SPIs 注:圖表中字母(a～f)表示不同品種大豆分離蛋白 p<0.05水平的差異顯著性;圖2、表1同。

圖2　六種品種大豆分離蛋白的表面疏水性Fig.2　The surface hydrophobicity of six varieties of SPIs

分析原因可能是由于蛋白質(zhì)的溶解性與蛋白質(zhì)分子表面的親水性/疏水性的平衡有關(guān),當(dāng)這種平衡發(fā)生改變,兩種性質(zhì)隨之改變,表面的疏水性殘基的多少起著決定性作用,疏水性殘基相對較多具有較好的表面疏水性[19-21]。Paraman等[22]對大米蛋白研究中也發(fā)現(xiàn)二者之間存在負(fù)的相關(guān)性,Hayawaka and Nakai[23]曾報道表面疏水性與不溶解性成正相關(guān)。然而,Boatright and Hettiarachchy[24]研究表明大豆分離蛋白的溶解性和表面疏水性呈現(xiàn)正相關(guān),相似的結(jié)論在大米蛋白中得到證明[25]。

表1　六種大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)成比例(%)Table 1　Content of the secondary structure in six varieties of SPIs(%)

2.2圓二色譜(CD)檢測結(jié)構(gòu)的分析

圓二色譜(250～200 nm)是一種測量蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的靈敏技術(shù),能夠表征主鏈構(gòu)象,尤其在水溶性蛋白溶液中。它能直接用來解釋蛋白的二級結(jié)構(gòu)四種類型的含量。本實驗采用200～250 nm遠(yuǎn)紫外光譜下測定六種品種大豆分離蛋白的圓二色譜,測定結(jié)果如圖3所示。圖3縱坐標(biāo)為蛋白的平均摩爾橢圓率大小,通過CDPRO軟件分析圓二色譜圖數(shù)據(jù),計算α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲的含量見表1。由表1可知,六種大豆分離蛋白的α-螺旋含量大小依次為26.5%(冀NF58)>22.7%(中黃13號)>21.9%(五星4號)>17.1%(黑農(nóng)46號)>15.9%(皖豆24號)>15.8%(東農(nóng)46號),而β-折疊含量大小順序為32.7%(東農(nóng)46號)>32.1%(皖豆24號)>31.0%(黑農(nóng)46號)>28.5%(五星4號)>27.4%(中黃13號)>24.5%(冀NF58),無規(guī)則卷曲的含量依次為30.5%(皖豆24號)>29.7%(黑農(nóng)46號)>29.1%(東農(nóng)46號)>27.6%(五星4號)>27.5%(中黃13號)>26.6%(冀NF58)。他們的β-轉(zhuǎn)角含量變化不明顯,中黃13號、五星4號、黑農(nóng)46號、皖豆24號、東農(nóng)46號的β-轉(zhuǎn)角含量在22.1%～22.5%之間,比冀NF58含量高約1%。

圖3　六種大豆分離蛋白的圓二色圖譜Fig.3　Far-UV CD spectra of six varieties of SPIs

通過分析數(shù)據(jù)可知,六種大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以β-折疊和無規(guī)則卷曲為主,這一現(xiàn)象與前人報道是一致的[26-27]。不同品種大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)存在差異,除β-轉(zhuǎn)角含量無顯著性差異外,其他三種結(jié)構(gòu)存在顯著性差異。通過不同品種大豆分離蛋白二級結(jié)構(gòu)含量的比較,隨著α-螺旋含量的降低,β-折疊及無規(guī)則卷曲含量顯著升高,β-轉(zhuǎn)角含量增加不明顯。導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面疏水性較大的原因可能是因為當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子內(nèi)無序結(jié)構(gòu)含量相對較高時,蛋白質(zhì)分子的無序性增加,隱藏在內(nèi)部的疏水性位點更多的顯露出來,這一現(xiàn)象佐證了王辰等[17]關(guān)于利用紅外光譜法對大豆分離蛋白品種差異與表面疏水性構(gòu)效關(guān)系的研究結(jié)論。

2.3相關(guān)性分析

通過本實驗的研究可以得出:對六種大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu)與表面疏水性二者數(shù)值進行線性相關(guān)性分析,六種大豆分離蛋白的β-折疊含量與表面疏水性之間存在極顯著的線性正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.950(p<0.01);無規(guī)則卷曲含量也同樣與其存在極顯著的正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.923(p<0.01);α-螺旋含量與表面疏水性之間具有極明顯的線性負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.968(p<0.01);β-轉(zhuǎn)角含量與表面疏水性之間無顯著的線性關(guān)系。

表2　六種大豆分離蛋白的二級結(jié)構(gòu) 與表面疏水性相關(guān)性分析Table 2　The relationship between surface hydrophobicity(SH) and secondary structure in six varieties of soy protein isolate(SPI)

3　結(jié)論

不同品種大豆分離蛋白的表面疏水性與品種密切相關(guān),表面疏水性隨著大豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量降低而增大,β-折疊及無規(guī)則卷曲含量升高而增大。通過本實驗的研究,明確了二級結(jié)構(gòu)對疏水性的影響規(guī)律,為今后開發(fā)大豆分離蛋白特定產(chǎn)品而進行分子設(shè)計和重組提供重要的理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

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Effect of secondary structure determined by CD spectra on surface hydrophobicity of soybean protein isolate

WANG Chen1,JIANG Lian-zhou2,*

(1.Dali University,Dali 671003,China;2. Northeast Agriculture University,Harbin 150030,China)

CD(circular dichroism spectra)was applied to research on the relationship between surface hydrophobicity(SH)and secondary structure in six varieties of soy protein isolate(SPI). First step was the extraction of SPIs,the functional abilities(surface hydrophobicity and solubility)and the secondary structure of the six varieties of SPI were measured and analyzed. Through SPSS software,the numerical linear correlation bewteen surface hydrophobicity and secondary structure of six varieties of soybean protein isolate was analyzed to explore the structure-activity relationship between them. The results revearled that there were significant differences(p<0.05)bewteen the secondary structure and the functional abilities(surface hydrophobicity and solubility). The SH of the six varieties of SPI increased with the decrease ofα-helix content,and decreased with the increase of random coil andβ-sheet content,and the linear relationship between the SH andβ-turn content was not obvious. SPSS linear correlation analysis showed that the SH of the six varieties of SPI had no significant linear relationship withβ-turn content,positively related to random coil andβ-sheet content,and negative correlated toα-helix content.

soybean protein isolate;surface hydrophobicity;circular dichroism

2015-12-29

王辰(1987-)，女，碩士，助教，研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程,E-mail：cc198772@163.com。

江連洲(1960-)，男，博士，教授，研究方向:糧食、油脂及植物蛋白工程,E-mail：jlzname@163.com。

TS207.3

A

1002-0306(2016)14-0134-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.018