玉米赤霉烯酮一步ELISA法的建立及應用

王文珺,劉怡菲,韓　霄,王照鵬,蘇麗芳,敖海闊,吳雨洋

(1.北京維德維康生物技術有限公司,北京 100095;2.河北獸藥監察所,河北石家莊 050035;3.北京交通大學理學院,北京 100044)

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玉米赤霉烯酮一步ELISA法的建立及應用

王文珺1,劉怡菲2,韓霄3,王照鵬1,蘇麗芳1,敖海闊1,吳雨洋1

(1.北京維德維康生物技術有限公司,北京 100095;2.河北獸藥監察所,河北石家莊 050035;3.北京交通大學理學院,北京 100044)

為了建立一種快速、準確的檢測飼料及其原料中玉米赤霉烯酮的酶聯免疫一步法。在制備玉米赤酶烯酮半抗原、免疫原及單克隆抗體的基礎上,運用方陣法確定包被抗原、抗體的濃度,篩選穩定的ELISA檢測體系,并在此基礎上考察了抗體的特異性。建立了檢測飼料及其原料中玉米赤霉烯酮的方法,豬飼料、牛飼料、玉米渣和麥麩的檢測限分別為96.2、92.7、80.5和86.7 μg/kg。在飼料及原料中定量添加玉米赤霉烯酮,酶聯免疫的回收率為79.4%～104.9%,開發的酶聯免疫試劑盒與德國拜發試劑盒對實際樣本進行檢測,兩種試劑盒對樣本陰陽性判定一致。本研究為飼料及其原料中玉米赤酶烯酮的監管提供了技術支撐。

玉米赤霉烯酮,半抗原,單克隆抗體,酶聯免疫吸附分析法(ELISA),飼料及其原料

由飼料污染導致的食品質量安全問題引發越來越多的關注,真菌毒素是飼料污染的重要原因。據統計,每年全世界的農產品和工業原料因真菌毒素污染引起的損失達數百億美元[1]。玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是一種常見的真菌毒素,最初從患赤霉病的玉米中分離得到,其主要污染玉米和小麥等糧食。ZEN引起的污染相當廣泛[2],中國、美國、加拿大、英國等國家相繼報告了由ZEN污染糧食引起的豬中毒事件。李榮濤[3]曾從全國各地采集玉米、小麥樣本進行分析,發現樣本中ZEN陽性率為100%,濃度范圍為0.014～0.73 mg/kg。被ZEN污染的飼料一旦被動物食用,可引起動物中樞神經中毒,對于妊娠期的動物,可能會引起流產、死胎、畸胎等[4]。ZEN會通過食物鏈傳遞給人體,危害人類的健康。ZEN的存在日益引起人們的關注[5],近年來,人們著手研究建立了多種檢測ZEN的方法。ZEN儀器分析方法主要有液質聯用(LC-MS/MS)和高效液相色譜(HPLC)等[6-9],可同時定量檢測ZEN及其代謝物α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇等[10-11],但儀器分析需要昂貴的儀器,檢測周期長,不適合快速對大量樣本的檢測,常被用來作為確證的方法。因此,急需開發出一種靈敏度高、準確的ZEN快檢方法,以滿足社會對ZEN污染情況的監控。ELISA具有高靈敏度、高通量、操作簡便等優點,可實現短時間內對大量樣本的篩查。美國分析化學家協會(AOAC)率先將ELISA應用于檢測谷物、小麥、豬飼料中的ZEN[12]。我國GB/T13078.2-2006規定飼料中ZEN限量標準為500 μg/kg[13],檢測飼料中ZEN的國標方法包括薄層色譜法、ELISA以及免疫親和柱—高效液相色譜聯用技術等[14-15]。目前,人們已逐步將免疫分析技術應用于真菌毒素檢測的研究[16-19]。ZEN標準品的穩定性直接影響ELISA方法的產業化,但很少有文獻報道涉及這方面的研究。

本研究系統闡述了ZEN抗原抗體制備、檢測體系建立、樣本分析,建立了飼料及其原料中ZEN的檢測方法(檢測限100 μg/kg),探討了保持標準品穩定性的思路及方法,以期為真菌毒素類ELISA方法的應用提供技術依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇中國獸藥監察所;Proclin 300、明膠、酶穩定劑、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等Sigma公司;羊抗鼠IgG-HRP美國Jackson公司;ELISA酶標板廈門云鵬;新生牛血清民海生物;吡啶、甲醇等分析純化合物北京國藥集團;ELISA所用的緩沖液包被液:碳酸鹽緩沖液0.05 mol/L,pH9.6;磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L,PBS):PB緩沖液中加入0.15 mol/L NaC1,pH7.4;洗滌液:1000 mL PBS加1 mL Tween-20;酶稀緩沖液:2 mL Tween-20、1 g明膠、200 mL新生牛血清、0.2 g酶穩定劑和300 μL ProClin 300,加入到0.02 mol/L PBS中,定容到1000 mL;封閉液:1000 mL PBS加入5 g明膠、2%蔗糖和500 μL ProClin 300;專用標準品緩沖液:0.02 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,pH6.0;A/B雙組份顯色底物液:北京維德維康生物技術有限公司自制;終止液:1 mol/L H2SO4。

MK3酶標儀美國,Thermo fisher科技;TDL-40C離心機上海安亭科學儀器廠;HQ-60型渦動儀北京方正生物科技發展有限公司;Milli-Q型超純水儀美國,Milli-Q公司;微量移液器德國,Eppendorf;90-3 型磁力攪拌器上海青浦滬西儀器廠;電子天平德國,賽多利斯科學儀器公司。

1.2實驗方法

1.2.1ZEN半抗原(玉米赤霉烯酮-6′-羧甲氧肟)的合成由于ZEN本身沒有活性基團,無法直接偶聯蛋白,需要先合成半抗原,參考Liu的方法[20]略有改動。ZEN(10 mg)溶于6 mL吡啶中,加入8.0 mg O-羧甲基羥胺半鹽酸鹽,攪拌反應24 h,真空干燥后的殘留物溶于5 mL蒸餾水中,用Na2CO3將pH調到8.0,用乙酸乙酯從水相中除去未反應的ZEN。水相的pH用HCl調到3.0,沉淀反應產物,并用10 mL乙酸乙醋提取四次,提取物用無水Na2SO4干燥,減壓濃縮得半抗原ZEN-CMO。

1.2.2活性酯法制備ZEN人工抗原人工抗原制備參考王照鵬的方法[21],略有改進。將5.19 mg ZEN-CMO溶于2 mL 二甲基甲酰胺(DMF)中,加入5.0 mg NHS 和6.0 mg EDC中,室溫攪拌反應2 h,得到活化的A液;稱取67 mg BSA溶于5.0 mL 0.02 mol/L(pH7.4)的PBS中,得到B液;在4 ℃條件下,邊攪拌邊在B液中緩慢的加入A液,然后室溫攪拌24 h;將反應產物裝入干凈的透析袋(15 cm)中,用0.01 mol/L PBS(pH7.4)在4 ℃下攪拌透析3 d,每天更換透析液3次,透析產物(免疫原:ZEN-CMO-BSA)在4500 r/min離心6 min,0.5 mL/管分裝,將抗原編號,-20 ℃保存備用。ZEN-CMO-BSA制備方法見圖1。同法合成包被原ZEN-CMO-OVA。

1.2.3ZEN單克隆抗體制備制備單克隆抗體(單抗)的流程參考王文珺描述的方法[22]:免疫Balb/C小鼠,待效價大于5000后,取小鼠脾臟與骨髓瘤細胞融合,用選擇培養基篩選雜交瘤細胞,經五次克隆后,篩出穩定分泌ZEN抗體的細胞,細胞培養上清或注射小鼠體內產生的腹水含有大量的ZEN單克隆抗體。經進一步純化后可用于ZEN試劑盒研發。

1.2.4ZEN標準抑制曲線的建立首先,方陣法篩選抗原、抗體的工作濃度,建立間接競爭性ELISA(icELISA)的標準曲線[23]:a.包被:以確定的抗原濃度包被酶標板,4 ℃過夜,棄包被液,洗滌一次;b.封閉:加入封閉液(150 μL/孔),室溫下封閉2 h,棄封閉液,拍干;c.加樣:取50 μL不同濃度的標準品(0、0.1、0.2、0.4、0.8、2.4 ng/mL)分別加入各平行孔中,再按順序加入50 μL IgG-HRP工作液、50 μL ZEN單抗,避光反應30 min,洗滌四次;d.顯色:加入新鮮配制的底物液100 μL,避光孵育10～15 min;e.終止:加入50 μL終止液,在450 nm/630 nm 雙波長下讀出數據。

圖1　ZEN半抗原合成和偶聯物制備反應圖Fig.1　Reactions used to synthesize the hapten(ZEN-CMO)and conjugates(ZEN-CMO-BSA)

ZEN標準品濃度的對數為橫坐標,結合率(B/B0)為縱坐標。用軟件Origin 8.0繪制標準曲線,建立四參數回歸方程[24]:

其中:Y為結合率;A1代表零標準品的OD值；A2是最高濃度標準品的OD值；P為曲線拐點的斜率;X0為IC50所代表的藥物濃度。

1.2.5ZEN抗體的特異性考察ZEN單抗與其結構類似物的交叉反應,分別建立標準抑制曲線,計算各自的IC50,按下式計算交叉反應率:

交叉反應率(CR%)=IC50(ZEN)/IC50(結構類似物)×100

1.2.6標準品穩定性考評三種標準品緩沖液(標緩)配制標準品:0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)、0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)+20%甲醇、專用標準品緩沖液(見1.1)?？疾觳煌瑯司徶袠藴势吩?、37 ℃放置0、3、6、9 d的情況,通過考評IC50值、零孔OD值選擇合適的標緩。

1.2.7樣品的測定

1.2.7.1添加實驗稱取粉碎后的待測樣品1.0 g于50 mL離心管中,樣品包括:豬飼料(幼仔)、牛飼料(肉牛)、玉米渣、麩皮,每種樣品稱量4份,樣品分別按100、200、500 ng/g濃度添加ZEN,同時設置未添加ZEN的試樣平行處理做空白。然后加入6 mL樣品稀釋液(20%甲醇+0.02 mol/mL PBS),高速渦動2 min后4000×g離心10 min;取20 μL上清液用380 μL樣品稀釋液,充分混勻后,取50 μL用于ELISA分析。

1.2.7.2實際樣本分析用本研究開發的試劑盒(WDWK)和德國拜發(RIDA)試劑盒對20個實際樣本進行分析,通過檢測結果的比對,確定該檢測方法的準確性。

2　結果與討論

2.1ZEN人工抗原及單抗制備

ZEN是一種小分子物質(MW=318.6),需要與大的載體蛋白(如BSA、OVA、KLH等)偶聯才具有免疫原性。本研究在保持ZEN基本空間構型的前提下,合成具有羧基長鏈的半抗原,通過羧基與載體蛋白BSA偶聯制備免疫原。根據紫外掃描確定ZEN與BSA的偶聯比為12.8∶1(見圖2)。一般來說,偶聯比在8∶1～25∶1范圍內,免疫效果較好。免疫小鼠制備單克隆抗體,經過四次克隆,獲得一株能穩定分泌抗體,編號為4C-1H-5F-3D細胞株。

圖2　偶聯物的紫外圖譜Fig.2　UV spectrum of conjugates

2.2ZEN 標準抑制曲線

在優化條件下,建立ZEN的標準抑制曲線(圖3),IC50=0.35 ng/mL,低于文獻報道中的IC50=(1.13±0.16) μg/L及線性范圍為1～50 ng/mL的檢測結果[16,20]。本研究采用一步法,即抗原、抗體和酶標二抗的反應一步完成,如果采用傳統的兩步法,IC50值更低(IC50=0.19 ng/mL)。但這樣會增加檢測步驟,延長檢測時間,不符合快檢產品的要求。在保證檢測限滿足國標的情況下,本文優先考慮一步法。

圖3　ZEN標準抑制曲線Fig.3　The standard inhibition curve of ZEN determined by icELISA

2.3抗體特異性

ZEN單抗的特異性用其與ZEN結構類似物的交叉反應來表示。由表1可知,ZEN單抗與歐盟及農業部“235”號公告[25]禁用藥物玉米赤霉醇有很大的交叉,因此該抗體也可用來開發玉米赤霉醇的檢測試劑盒?？贵w與其結構類似物的交叉反應越大,說明該結構類似物具有與待測物相同或相近結構,即相同的抗原決定簇。在免疫檢測中,交叉反應的存在常被利用檢測一類物質,如磺胺總量的檢測。

表1　ZEN抗體的交叉反應Table 1　Cross-reaction of ZEN and structurally related compounds

表2　標準品的穩定性考評Table 2　Evaluation for stability of standard

表3　飼料及其原料*中添加ZEN回收實驗Table 3　Recovery for ZEN from Feed and feedstuffs* by icELISA

注:*:飼料及原料陰性樣本來自農業部飼料工業中心。

2.4穩定性考評

標準品的穩定性是ELISA試劑盒質量控制的一個重要指標[26-28]。ZEN屬于內酯類化合物,如選擇的標緩不合適,會引起ZEN的空間構型發生改變,影響抗原-抗體的特異性結合,即破壞了ZEN標準品的穩定性。關于ZEN ELISA的研究報告,很少涉及標準品的穩定性的研究[17,29-30]。事實上,真菌毒素類標準品的穩定性是制約其產品穩定的關鍵因素。

根據阿倫尼烏斯公式[31],試劑在37 ℃條件下(熱加速實驗)放置1 d,相當于4 ℃條件下保存1.6個月,9 d熱加速實驗相當于4 ℃保存一年兩個月。在試劑研發過程中,常用熱加速實驗考察試劑的穩定性。本研究工作重點考察了不同緩沖液配制的標準品在4 ℃和熱加速實驗條件下參數的變化情況,不同考評天數之間的數值,最大允許存在40%以內的差異,不同處理方法之間的差異不應該超過20%(以4 ℃為對照),對稀釋倍數較大的前處理方法,這種差異應該控制在10%之內。由表2 OD值和IC50可以看出,使用專用標緩可以很好地維持標準品的穩定性。

2.5樣本分析

2.5.1添加實驗在陰性樣本中添加不同濃度ZEN,添加回收率范圍在79.4%～107.9%之間(見表3),結果表明,樣本前處理方法準確,可滿足市場需求。

同時,通過對大量陰性樣本的篩查,得到豬飼料(幼仔)、牛飼料(肉牛)、玉米渣、麩皮的檢測限分別為96.2、92.7、80.5、86.7 μg/kg。

2.5.2實際樣本分析通過Wdwk和RIDA試劑盒對20個實際樣本的分析(結果見表4),經單因素方差分析,兩種方法的分析方法結果無顯著差異(p>0.05)。檢測樣本中沒有ZEN濃度≥500 μg/kg的樣本。

表4　WDWK試劑盒與RIDA試劑盒檢測結果的比較Table 4　Comparision of results determinedly by WDWK kits and RIDA kits

3　結論

本研究在制備高靈敏度抗體的前提下,采用一步ELISA法,開發出具有反應時間短、操作簡單、結果穩定的ELISA試劑盒,滿足市場對快檢免疫試劑的要求。本研究工作的重點是解決了ELISA試劑盒中ZEN標準品穩定性問題,采用了專用緩沖液,標準品可穩定保存12個月。在樣本添加實驗中,回收率在79.4%～107.9%之間,實際樣本分析表明本研究開發的試劑盒與德國拜發試劑盒的檢測結果非常接近,進一步證明了本研究工作的可靠性及可行性。

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Development and application of one-step enzyme-linked immunosorbent assays for zearalenone

WANG Wen-jun1,LIU Yi-fei2,HAN Xiao3,WANG Zhao-peng1,SU Li-fang1,AO Hai-kuo1,WU Yu-yang1

(1.Beijing WDWK Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 100095,China;2.Hebei Institute of Veterinary Drug Control,Shijiazhuang 050035,China;3.College of Science,Beijing Jiaotong University,Beijing 100044,China)

With aim of developing a speed,accurate,one-step enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)for the detection of zearalenone in feed and feed stuffs was set. Hapten was synthesized firstly,conjugated then to carrier proteins for complete antigen,which was used as antigen in mice for monoclonal antibody. Concentrations of coating antigen and antibody were determined with chessboard format. A stable analytical system was established and the specificity of monoclonal antibody was evaluated. The results showed that the detection of limit of this developed ELISA for zearalenone in pig feed、cow feed、maize pulp and wheat bran was 96.2,92.7,80.5 and 86.7 μg/kg,respectively. Feed samples were spiked with zearalenone and the recoveries of ELISA were 79.4%～104.9%. There was no distinct difference between the results of WDWK and RIDA kits. This study could bring a technical basis for the monitor of zearalenone.

zearalenone;hapten;monoclonal antibody;enzyme-linked immunosorbent assays(ELISA);feed and feed stuffs

2015-11-24

王文珺(1975-)，女，博士，副研究員，研究方向：農業及環境毒物檢測研究，E-mail：wwj107@163.com。

河北省科技計劃項目(15277107D)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)14-0078-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.007