HPLC波長程序法同時檢測非發酵豆制品中堿性橙和堿性嫩黃O的含量

孫記濤,阮長青,劉文靜,張雪路,李　芳,張愛武,張東杰

(黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江大慶 163319)

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HPLC波長程序法同時檢測非發酵豆制品中堿性橙和堿性嫩黃O的含量

孫記濤,阮長青*,劉文靜,張雪路,李芳,張愛武,張東杰

(黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江大慶 163319)

目的:建立非發酵豆制品中的堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22和堿性嫩黃O的HPLC波長程序法同時檢測的方法。方法:樣品采用不同溶劑超聲提取,提取液離心,上清液旋轉蒸發濃縮。樣液以甲醇-乙酸銨溶液為流動相,流速1.0 mL/min,經C18反相色譜柱分離,設定波長程序實現四種染料的同時檢測，并進行了方法學評價。結果:選擇乙醇為超聲提取的溶劑。堿性橙2、堿性橙21和堿性橙22和堿性嫩黃O的線性范圍為0.0～10.0 μg/mL,相關系數R2≥0.9990。檢出限在0.01～0.05 mg/kg之間,定量限在0.046～0.098 mg/kg之間。三個濃度(5.00、10.00、20.00 mg/kg)的加標回收率的范圍為90.38%～102.16%,相對標準偏差(RSD)范圍為1.37%～6.93%。結論:四種堿性染料的HPLC波長程序檢測方法滿足方法評價的要求,具有靈敏、準確、快速的特點。

高效液相色譜,波長程序法,堿性橙2,堿性橙21,堿性橙22,堿性嫩黃O,豆制品

堿性橙(包括堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22)和堿性嫩黃O為偶氮類堿性染料,主要應用于羊毛、蠶絲、棉、腈綸、紙張、涂料和麻等的染色,在中性或偏堿性的條件下有較強的吸附性,不易褪色。堿性橙有良好的抗菌、抗微生物的活性[1]。但偶氮類染料會在還原的條件下分解成還原的芳香胺類,具有致癌性、誘變性和蓄積作用[2-3],衛生部已將其列入《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單》中。而不法分子卻將堿性橙和堿性嫩黃O用于非發酵豆制品等其他食品的染色及防腐。

目前,檢測堿性橙和堿性嫩黃O的方法主要有HPLC-UV法[4-7]、HPLC-MS法[8-10]、GC-MS法[11]、薄層色譜法[12]、紫外-分光光度法[13]和ELISA法[14-15]。HPLC-MS法和GC-MS法雖然靈敏度高,但是儀器昂貴實驗成本高;薄層色譜法操作復雜定量準確率低;紫外-分光光度法存在靈敏度低的不足;ELISA法存在檢測結果重復性差、酶穩定性差、試劑壽命短等缺點。HPLC-UV法具有靈敏度高、高效、分析速度快和應用廣泛的特點,在多目標物檢測時,由于其最大吸收波長不同,需分別設定波長檢測,操作繁瑣、耗時長,目前,缺少同時檢測該四種堿性染料的方法。本文采用高效液相色譜紫外檢測器,通過設定波長程序保證各目標物在其最大吸收波長下進行檢測,建立同時測定非發酵豆制品中的堿性橙和堿性嫩黃O的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

干豆腐、腐竹、鹵香豆干購于大慶市場;堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22(純度≥98%)上海安譜科學儀器有限公司;堿性嫩黃O(純度≥99.5%)德國Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇、乙醇、乙腈、正己烷均為色譜純,美國天地公司;無水乙酸銨、甲酸均為優級純;無水硫酸鈉分析純;超純水電阻率18.2 MΩ·cm。

Lab Alliance PC-2000型高效液相色譜儀附205型可編程紫外可見檢測器美國SSI/Lab Alliance公司;RE-5286A型旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;FW80型粉碎機北京市永光明醫療儀器廠;PHS-3G型pH計上海雷磁儀器廠;752N型紫外可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司;KQ-400KDE超聲清洗器昆山超聲儀器有限公司;AR223CN型分析天平美國奧豪斯儀器有限公司;TG16-WS臺式高速離心機湘儀離心機儀器有限公司;AL-01型溶劑過濾系統天津奧特賽恩斯儀器有限公司;0.22 μm針式微孔濾膜天津津騰實驗設備有限公司;Synergy超純水系統MERCK MILLIPORE公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品前處理方法前處理方法在國家標準[4]的基礎上略加改進。方法如下:將粉碎后的樣品混勻后,準確稱取5.000 g于三支50 mL具塞離心管中,分別加入20 mL乙醇[4]、乙腈∶水=7∶3[5]、乙腈[16]作為提取溶劑,用快速混勻器混勻,放于超聲波清洗器中超聲30 min后,以4000 r/min的速度離心10 min,將上清液倒入另外一個離心管中,再加入20 mL提取溶劑,混勻離心,取上清液合并,將上清液離心后,用塞有脫脂棉的漏斗中加入適量的無水硫酸鈉過濾上清液于旋轉蒸發瓶中,旋轉蒸發至近干,用甲醇定容至10 mL的容量瓶中,用0.22 μm的濾膜過濾,待上機測試。若樣品含油量高則在旋轉蒸發至近干后用10 mL乙腈飽和的正己烷洗至分液漏斗中,加入15 mL乙腈萃取至旋轉蒸發瓶中,再旋轉蒸發至近干,用甲醇定容于10 mL容量瓶中,用0.22 μm的濾膜過濾,按照下述優化的色譜條件上機測試,確定最優提取溶劑。利用優化好的測定條件對大慶市場的干豆腐、腐竹及鹵香豆干樣品進行檢測,未加標的結果均未檢出四種堿性染料。

1.2.2測定條件確定四種堿性染料的最大吸收波長、色譜條件、優化流動相的pH。在這些條件下對四種堿性染料定性,根據保留時間和檢測波長確定波長程序。

1.2.2.1檢測波長使用紫外可見分光光度計分別對濃度為10.0 μg/mL的四種標準物質分別在400～500 nm[17](堿性嫩黃O、堿性橙2),400～550 nm[18](堿性橙21、堿性橙22)的波長范圍內進行掃描,通過響應值確定其最大吸收波長。

1.2.2.2色譜條件色譜柱:Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:甲醇+20 mmol/L乙酸銨溶液=65+35(pH=6.73);流速:1 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:10 μL。

1.2.2.3波長程序的設置根據四種堿性染料的最大吸收波長,設置波長程序。分別對四種堿性染料單一標準品進行定性分析,得到保留時間,順序依次為堿性橙2、堿性嫩黃O、堿性橙21及堿性橙22。通過四種堿性染料保留時間來設定相對應的波長來進行檢測,確保目標物在最大吸收波長下有最大的響應值。

1.2.2.4流動相pH在上述條件下,對四種堿性染料檢測,進樣濃度為2.0 μg/mL。對于出現拖尾或前沿現象時,使用甲酸調節流動相pH分別為3.00、3.50、4.00、4.50、5.00,通過色譜峰的保留時間、半高峰寬和色譜峰型,確定最優pH。

1.2.3方法評價通過標準曲線外標法定量,檢出限、定量限、精密度和準確度實驗,對確定好的樣品前處理方法和測定條件進行方法驗證。

1.2.3.1標準曲線將堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22及堿性嫩黃O分別用甲醇配制成濃度為1000 μg/mL的標準儲備液。分別用甲醇稀釋標準儲備液配制濃度為0.0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μg/mL的四種堿性染料成使用液,進樣,采用外標法通過峰面積和標樣的濃度的線性關系建立標準曲線。樣品進樣后的峰面積與曲線比較定量,得到樣品中目標物含量。

1.2.3.2檢出限與定量限通過對陰性樣品中逐級降低加標含量來確定檢出限和定量限,以信噪比S/N=3對應的目標物濃度作為檢出限,以信噪比S/N=10對應的目標物濃度作為定量限,得到四種堿性染料的檢出限和定量限。

1.2.3.3精密度同一操作者使用相同儀器設備、前處理方法和測定條件,對相同的樣品進行日內重復11次的加標回收率實驗。以干豆腐為樣品,加標量為10 mg/kg,得到方法精密度。另對2.0 μg/mL的混合標準品進行日間重復11次的測定,得到峰面積和保留時間的精密度。

表1　三種提取溶劑的回收率(n=7)Table 1　The recoveries in three kinds of extraction solvents(n=7)

1.2.3.4準確度對一個樣品同時加入四種堿性染料的標準物質使加標含量為5.00、10.00、20.00 mg/kg三個濃度進行回收率實驗,每個樣品進行7次平行實驗,驗證方法的準確度。

1.3數據處理

所有數據經過Microsoft Office Excel 2003進行數據分析和圖表的制作。

2　結果與討論

2.1提取溶劑的確定

不同提取溶劑的平均回收率實驗結果如表1所示。

表1結果表明,四種堿性染料的提取溶劑為乙醇的平均回收率在97.85%～99.64%之間,相對標準偏差(RSD)在1.28%～3.65%之間;提取溶劑為乙腈+水=7+3的平均回收率在92.37%～95.47%之間,RSD在1.50%～3.83%之間;提取溶劑為乙腈的平均回收率在94.12%～95.99%之間,RSD在3.32%～5.14%之間。因此本方法采用平均回收率高的乙醇為提取溶劑。

2.2測定條件

2.2.1檢測波長對四種堿性染料使用紫外可見分光光度計在適當波長范圍內進行掃描,確定其最大吸收波長。如圖1所示。

圖1　四種堿性染料的波長與吸光度的關系Fig.1　The relationship between wavelength and absorbance of four basic dyes

圖1表明,堿性嫩黃O、堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22的最大吸收波長分別為：430、448、494、494 nm。在對應的波長下有最大響應值,干擾物響應值小[19]。確定最大吸收波長為檢測波長。

2.2.2波長程序根據確定的最大吸收波長和四種堿性染料的保留時間,設置波長程序[20-22]。即,0～6 min波長設定為448 nm;6～7 min波長為430 nm;7 min后波長為494 nm。

2.2.3流動相pH在不同的pH下得到濃度為2.0 μg/mL標準品的保留時間和半高峰寬變化趨勢如圖2和圖3所示。得到的濃度為2.0 μg/mL混合標準品的色譜圖,如圖4和圖5所示。

圖2　流動相pH對保留時間的影響Fig.2　The effect of mobile phase pH on retention time

圖3　流動相pH對半高峰寬的影響Fig.3　The effect of mobile phase pH on peak width at half height

圖4　流動相pH=6.73時濃度為 2.0 μg/mL的混合標準品色譜圖Fig.4　The mixed standard chromatogram of mobile phase pH=6.73 at the concentration of 2.0 μg/mL 注:(a)為堿性橙2；(b)為堿性嫩黃O； (c)為堿性橙21；(d)為堿性橙22。

圖5　流動相pH=4.00時濃度為 2.0 μg/mL的混合標準品色譜圖Fig.5　The mixed standard chromatogram of mobile phase pH=4.00 at the concentration of 2.0 μg/mL 注:(a)為堿性橙2；(b)為堿性嫩黃O； (c)為堿性橙21；(d)為堿性橙22。

由圖2和圖3可知,流動相的pH減小,保留時間前移,半高寬也逐漸變小。由圖4可知,流動相未調整時pH為6.73,第一個峰(堿性橙2)有拖尾現象,可能有干擾峰重合,通過堿性嫩黃O的單標測定,存在雜質干擾。

表2　標準曲線、檢出限及定量限Table 2　The standard curve,the limit of detection and quantitation

表3　樣品連續測定結果(n=11)Table 3　The sample of continuous determination results(n=11)

表4　混合標準品峰面積和保留時間的精密度(n=11)Table 4　Peak area and retention time of mixed standard RSD(n=11)

由圖5可知,流動相pH=4.00時,可以明顯改善兩個峰的分離度。流動相pH減小,堿性染料分子的氨基質子化程度變大,摩爾吸光系數變大,峰面積變大,可以縮短保留時間并有效改善色譜峰的峰型[23-24]。同時檢測該四種堿性染料存在干擾峰,調節流動相的pH=4.00時,可以排除干擾峰。

2.3方法評價

2.3.1標準曲線及檢出限標準曲線、檢出限及定量限實驗結果見表2,在濃度范圍0.0～10.0 μg/mL內線性關系良好,相關系數R2≥0.9990;檢出限范圍為0.01～0.05 mg/kg;定量限范圍為0.046～0.098 mg/kg。

2.3.2精密度精密度可以反映在相同的條件下,多次重復測定結果的相互符合程度和儀器檢測結果的重現性。實驗進行了日內精密度和日間精密度評價,方法精密度重復性測定結果如表3所示。儀器中間精密度如表4所示。

由表3可知,同一操作者使用相同的儀器和相同的前處理方法,日內連續測定11次,得到的方法精密度,RSD范圍在2.55%～3.20%之間,方法重復性良好。

由表4可知,對2.0 μg/mL的混合標準品日間進行重復11次的測定,得到峰面積的RSD范圍在1.11%～4.19%之間,保留時間的RSD范圍在0.72%～1.35%之間,日間精密度良好,儀器穩定,可行性得到驗證。

2.3.3準確度所選的干豆腐、腐竹、鹵香豆干樣品均未檢出四種堿性染料,因此空白值可以不計。對一個樣品同時加入四種堿性染料的標準物質使三個濃度進行回收率實驗,每個樣品進行7次平行實驗,測定結果如表5所示。

表5　樣品加標回收率測定結果(n=7)Table 5　The recovery rate of standard addition in sample(n=7)

由表5可知,樣品平均回收率在90.38%～102.16%之間,RSD范圍在1.37%～6.93%之間,回收率實驗結果滿足有機殘留物和污染物關于加標回收率及其相對標準偏差的要求[25]。

3　結論

建立了非發酵豆制品中的堿性嫩黃O和堿性橙的HPLC波長程序法同時檢測的方法。對提取溶劑、流動相pH和四種堿性染料的吸收波長進行優化,并設置波長程序,確定超聲提取的溶劑為乙醇,流動相pH為4.00,波長程序為0～6 min(堿性橙2,448 nm),6～7 min(堿性嫩黃O,430 nm),7 min后(堿性橙21,堿性橙22,494 nm)。并對方法進行了準確度和精密度的評價,標準曲線線性關系良好,相關系數R2≥0.9990,檢出限在0.01～0.05 mg/kg之間,定量限在0.046～0.098 mg/kg之間,均滿足檢測需要。本法具有靈敏、準確、快速、成本低的特點。對非發酵豆制品及其他食品中四種堿性染料的測定有指導作用。

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Simultaneous detection of Basic Oranges dyes and Basic Flavine O dye contents in non-fermented soybean products by HPLC wavelength program method

SUN Ji-tao,RUAN Chang-qing*,LIU Wen-jing,ZHANG Xue-lu,LI Fang,ZHANG Ai-wu,ZHANG Dong-jie

(Food College of Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China)

:Objective:To establish a method for simultaneous detection of Basic Orange 2,Basic Orange 21,Basic Orange 22 and Basic Flavine O in non-fermented soybean products using HPLC wavelength program method. Methods:Samples solutions were extracted with different solvents under ultrasonic condition. The extract was centrifuged,and the upper solution was concentrated by rotary evaporator. The analysis was carried on C18column. The mobile phase was aqueous solution of methanol-ammonium acetate at the flow-rate of 1.0 mL/min,programmed wavelength ultraviolet detection was performed to simultaneously determine four dyes. In addition,the detection methodologies were evaluated. Results:Ethanol was selected as ultrasonic extraction solvent. The linear range of this method was 0.0～10.0 μg/mL for Basic Orange 2,Basic Orange 21,Basic Orange 22 and Basic Flavine O,and the correlation coefficient(R2)was higher than 0.9990.The limit of detection was between 0.01 mg/kg to 0.05 mg/kg,the limit of quantitation was between 0.046 to 0.098 mg/kg. The recoveries range of sample added standards of three concentrations(5.00,10.00,20.00 mg/kg)were 90.38%～102.16%,RSD was 1.37%～6.93%. Conclusion:The HPLC wavelength program detection method of Basic Orange and Basic Flavine O is able to meet requirements of the methodological evaluation,and it is sensitive,accurate and rapid.

high performance liquid chromatography;wavelength program method;Basic Orange 2;Basic Orange 21;Basic Orange 22;Basic Flavine O;bean products

2015-12-18

孫記濤(1987-)，男，碩士，研究方向：食品營養與安全，E-mail：18746034854@163.com。

阮長青(1968-)，男，博士，教授，研究方向：食品營養與安全，E-mail：cqruan@163.com。

黑龍江省高校“農產品加工與質量安全”創新團隊項目(2014TD006)；黑龍江八一農墾大學博士科研啟動項目。

TS207.3

A

1002-0306(2016)14-0073-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.006