一種測定原料肉中氨含量的分光光度法

周紀東,黃黃偉,朱城杰,魏曉玲(.浙江育英職業技術學院 生物技術系,杭州 3008; .浙江兩岸食品連鎖有限公司,杭州 3008)

一種測定原料肉中氨含量的分光光度法

周紀東1,黃黃偉2,朱城杰1,魏曉玲2
(1.浙江育英職業技術學院 生物技術系,杭州 310018; 2.浙江兩岸食品連鎖有限公司,杭州 310018)

為判定原料肉的新鮮度,建立一種測定原料肉中氨含量的分光光度法.分光光度法以對羥基苯甲酸鈉(PHB)為顯色劑,研究原料肉中氨含量與吸光度的關系.結果表明,1.0mL肉浸液中加入3.0mL PHB溶液和1.5mL次氯酸鈉溶液,于37℃水浴加熱30min,在695nm處測定吸光度,在0.00～20.00μg/25mL范圍內氨含量與吸光度呈現出良好的線性關系.分光光度法具有較高的準確度、精確度和靈敏度,操作簡單,對儀器、試劑要求不高,可作為測定原料肉新鮮度的備選方法,面向中小型肉類加工企業推廣與應用.

原料肉;氨;新鮮度;分光光度法

0　引 言

肉類在貯存、運輸與銷售等過程中,其新鮮度極易發生變化,甚至腐敗變質.因此,研究快速、簡便、準確的肉類新鮮度檢驗技術,不僅是肉類生產加工企業和政府食品安全監管部門的迫切需求,更直接關系到廣大消費者的身體健康[1].

新鮮的肉中氨含量非常低,當其腐敗變質時才會產生大量氨及銨鹽(合稱為粗氨)等堿性含氮的特征產物,與腐敗程度具有一定的相關性[2].因此,肉中粗氨含量可作為判定其新鮮度的一項重要的衛生指標.目前,肉中氨檢驗采用納氏試劑進行定性判斷[3],尚無準確的定量方法,而且納氏試劑還存在成分具有毒性、配制步驟繁瑣和不易存放等問題.本研究基于Berthelot反應,建立一種定量測定原料肉中氨含量的分光光度法,旨在為相關企業、監管部門判定原料肉的新鮮度提供一種新方法.

1　材料與方法

1.1反應原理

基于Berthelot反應原理,粗氨在堿性溶液中可與次氯酸鹽生成氯胺,在硝普鈉(亞硝基鐵氰化鈉)的催化下,與酚類物質反應生成藍色的靛酚藍染料.該物質性質穩定,而且其吸光度與樣液中氨含量在一定范圍內呈線性關系,故可比色測定.

1.2儀器與試劑

試驗樣品選用的原料肉為新鮮牛肉,取自浙江兩岸食品連鎖有限公司.試劑均為國產分析純,標準物氯化銨為優級純.溶劑用水為無氨蒸餾水.溶液有氨標準貯備液和使用液、PHB溶液、次氯酸鈉溶液.氨標準貯備液:稱取1.571 0g于105～110℃干燥恒重的氯化銨,加適量水溶解后移入100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混勻待用.此溶液每毫升相當于5 000μg的氨.氨標準使用液:臨用前,準確吸取氨標準貯備液1.00mL,置于1 000mL容量瓶中,加水定容至刻度.此溶液每毫升相當于5.0μg的氨.PHB溶液:稱取30.0g PHB、0.20g硝普鈉溶于300mL水后過濾,濾液中加入20.0g酒石酸鉀鈉,溶解后加水定容至500mL,4℃保存.次氯酸鈉溶液:稱取20.0g氫氧化鈉溶于100mL水,冷卻后加入安替福民溶液2.0mL,攪勻后加水定容至200mL,4℃保存.試驗使用的主要設備有:UV-1800紫外可見分光光度計(島津企業管理(中國)有限公司)、THZ-82B氣浴恒溫振蕩器(金壇國旺實驗儀器廠)、HH-2數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司).

1.3方法

1.3.1原料肉樣品處理.取適量原料肉按采樣和制樣要求[4]制備5份新鮮肉樣,每份10.0g.其中,1份肉樣立即制備肉樣浸提液(簡稱肉浸液),編號為0,其余肉樣室溫放置,每隔24h取1份制備肉浸液,依次編號為1～4.10%肉浸液制備方法為1份肉樣置于盛有100mL水的碘量瓶中,蓋塞后不斷振蕩使肉樣均勻分散,浸提30min后過濾,濾液置于4℃保存.

上述0～4號肉浸液按照GB/T 5009.44-2003《肉與肉制品衛生標準的分析方法》[5](以下簡稱國標法)測定總揮發性鹽基氮(Total volatile basic nitrogen, TVB-N)含量,TVB-N值分別為7.19、16.53、40.60、85.37、180.96(mg/100g).依據國家標準中TVB-N≤15mg/100g可判定為新鮮肉[6],故選擇0號和1號肉浸液分別作為新鮮肉和變質肉浸液.

1.3.2分光光度法測定條件的優化.

(1)測定波長的確定.取2支25mL具塞比色管,分別準確加入1.0mL氨標準使用液和1號肉浸液,然后2支管均依次加入2.0mL溶液、1.0mL次氯酸鈉溶液,搖勻,置于35℃恒溫水浴中加熱20min,取出后冷卻至室溫,加水定容,用1cm比色皿于300～800nm區域分別掃描吸收曲線.以1.0mL蒸餾水作空白對照.

(2)反應條件的確定.準確吸取1.0mL氨標準使用液置于25mL具塞比色管中,參照(1)中步驟及在其所確定的測定波長下,分別考察P HB溶液用量、次氯酸鈉溶液用量、反應溫度、反應時間等單因素對吸光度的影響,據此確定最佳反應條件.

1.3.3標準曲線的建立.準確吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.20、1.60、2.00、3.00、4.00(mL)氨標準使用液(相當于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0(μg)氨),分別置于10支25mL具塞比色管中,按照(2)中確定的最佳測定條件測定10支管的吸光度,以氨濃度(μg/25mL)為橫坐標、吸光度為縱坐標作圖繪制標準曲線.

2　結果與分析

2.1測定條件的優化

2.1.1吸收光譜與測定波長的確定.氨標準使用液和肉浸液的吸收曲線非常相似,其顯色反應產物均呈現出兩個明顯的吸收峰,即第一個吸收峰在400nm處,根據Berthelot反應原理,推測該吸收峰是由過量的硝普鈉產生的[7];第二個吸收峰在695nm處,是由顯色反應產物靛酚藍染料產生的,如圖1所示.本試驗選擇695nm作為分光光度法的測定波長.

圖1 顯色反應產物的吸收曲線

2.1.2反應條件的確定.

(1)PHB溶液用量對吸光度的影響.取7支25mL具塞比色管,分別準確加入1.0mL氨標準使用液,按照1.3.2(1)中步驟操作,其中改變7支管加入PHB溶液用量,測定波長為695nm,其余步驟條件不變,結果如圖2所示.

圖2　PHB溶液用量的影響

由圖2可知,試劑用量在3.0～4.0mL范圍內,其顯色效果穩定且吸光度較大,故PHB溶液用量可取3.0mL.

(2)次氯酸鈉溶液用量對吸光度的影響.取6支25mL具塞比色管,分別準確加入1.0mL氨標準使用液,按照1.3.2(2)中步驟操作,其中改變6支管加入次氯酸鈉溶液用量,測定波長為695nm,其余步驟條件不變,結果如圖3所示.

圖3　次氯酸鈉溶液用量的影響

由圖3可知,隨著試劑用量遞增,吸光度變化呈現出前期平穩上升,至用量為1.5mL時達到最大,其后顯著下降,故次氯酸鈉溶液用量可取1.5mL.

(3)反應溫度對吸光度的影響.取8支25mL具塞比色管,分別準確加入1.0mL氨標準使用液,按照1.3.2(1)中步驟操作,其中改變8支管的反應溫度,測定波長為695 nm,其余步驟條件不變,結果如圖4所示.

由圖4可知,吸光度隨著反應溫度遞增而發生顯著變化,至37℃時達到最大值,其后逐步下降,故反應溫度可設為37℃.

(4)反應時間對吸光度的影響.取6支25mL具塞比色管,分別準確加入1.0mL氨標準使用液,按照1.3.2(1)中步驟操作,其中改變6支管的反應時間,測定波長為695 nm,其余步驟條件不變,結果如圖5所示.

圖4　反應溫度的影響

圖5　反應時間的影響

由圖5可知,顯色反應30min內,反應時間對吸光度顯著影響,至30min時吸光度達到較大值,其后在30～60min內顯色效果保持穩定,60min后吸光度趨于下降,至90min時下降顯著.這表明顯色反應產物在1h內穩定,考慮到測定工作效率,反應時間應選擇30min為宜,并在1h內完成吸光度測定工作.

分光光度法的最佳測定條件為:25mL具塞比色管中加入1.0mL氨標準使用液,依次加入3.0mL PHB溶液和1.5mL次氯酸鈉溶液,充分混勻,37℃水浴加熱30min,冷卻至室溫,在695nm處測定吸光度.

2.2標準曲線的建立

在測定波長695nm處,氨濃度在0.00～20.00 μg/25mL范圍內與吸光度呈現出良好的線性關系(見圖6),線性方程為y=0.0477x+0.0118(R=0.9996,n=9).肉樣中氨含量C的計算公式為:

其中,C為肉樣中氨含量(μg/g),A為測試液的吸光度.

由此得出,分光光度法檢測肉樣中氨含量的有效范圍為0.00～200.00μg/g,最低檢測限為1.72μg/g.

2.3精密度試驗

圖6　吸光度對氨濃度的標準曲線

取6支25mL具塞比色管,分別準確加入1.0mL 1號肉浸液,按照2.1.2中確定的最佳測定條件操作,測定6支管的吸光度,結果見表1.

由表1可知,該組數據結果的相對標準偏差R S D小于1%,表明分光光度法精密度高且可靠性好.

表1　精密度試驗結果

2.4回收率試驗

取5支25mL具塞比色管,分別準確加入1.0mL 1號肉浸液,編號0～4,5支管分別加入0.00、0.10、0.20、0.30、0.40mL氨標準使用液(相當于0.00、0.50、1.00、1.50、2.00(μg)氨),按照2.1.2中確定的最佳測定條件操作,測定5支管的吸光度,根據標準曲線方程計算出相應的氨濃度,結果見表2.

表2　回收率試驗結果

由表2可知,樣品加標回收率在97.30%～106.00%之間,回收率均值接近100%,且其RSD小于5%,表明分光光度法準確度較高,測定結果可信.

2.5肉浸液放置時間的影響

將制備好的1號肉浸液常溫放置,之后每隔1 h準確吸取1.0～25mL肉浸液置于具塞比色管中,按照2.1.2中步驟操作完成顯色反應,測定1次吸光度,測定波長為695nm,如圖7所示.

由圖7可知,常溫下放置超過3h,肉浸液中氨濃度開始顯著增加,故制備好的肉浸液應及時開展和完成測定工作,若需延時測定,則肉浸液必須低溫保存.

2.6實際樣品測定與比較試驗

圖7 肉浸液放置時間的影響

準備5份新鮮肉樣,每份10.0g,按照1.3.1中步驟操作,每隔24h取1份肉浸液,編號為0～4號.每種肉浸液均按照國標法[5]測定TVB-N含量,同時準確吸取1.0mL肉浸液置于25mL具塞比色管中,按照分光光度法測定氨含量,每次測定均做3個平行試驗,結果見表3.

表3 分光光度法與國標法測定的結果比較

由表3可知,肉樣放置時間與分光光度法測得的氨含量和國標法測得的TVB-N含量均呈正相關,表明分光光度法測得的氨含量可用于定量表征肉樣腐敗變質的變化過程.其中,肉樣放置0～48h,測得氨含量小于200.00μg/g,處于分光光度法的有效測定范圍內;肉樣放置4 8h以上,則難以保證測定的準確度與精密度.分光光度法在準確度上可與國標法達到一致,在精密度上能超過國標法,加之相比于國標法,其操作更為簡便省時,大大提高了批量檢測的工作效率,故非常適用于原料肉新鮮度的快速檢測,可作為國標法之外的一種備選方法.

3　結 論

本文構建的分光光度法應用于肉樣中微量氨測定,可在有效測定范圍內表現出較高的準確度、精密度和靈敏度,所測結果可有效判斷原料肉的新鮮度.加之其對儀器、試劑要求不高,操作簡單,可面向中小型肉類加工企業推廣與應用,具有一定的應用前景和經濟價值.

[1]張應龍,王立東,戰偉偉,等.肉品新鮮度快速檢測技術研究進展[J].肉類研究,2011(8):42-46.

[2]周光宏.肉品加工學[M].北京:中國農業科技出版社,2009:142.

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[4]食品分析[M].大連輕工業學院,華南理工大學,鄭州輕工業學院,等編.北京:中國輕工業出版社,2007:99-103.

[5]中華人民共和國衛生部.GB/T 5009.44-2003 肉與肉制品衛生標準的分析方法[S].北京:中國標準出版社,2003.

[6]胡亞云,李志成,梁娜,等.比色法測定原料肉新鮮度方法的建立[J].食品工業科技,2014(18):59-62,66.

[7]陶輝,王玲,李星,等.飲用水氯胺法消毒過程中一氯胺的水楊酸分光光度法測定[J].環境化學,2009(1):126-131.

[責任編輯:吳春琴]

A Spectrophotometry to Test Ammonia Content in Meat Used as Raw Materials

ZHOU Jidong1, HUANG Wei2, ZHU Chengjie1, WEI Xiaoling2
(1.Biotechnology Department, Zhejiang Yuying Vocational Technology College, Hangzhou, 310018, China; 2.Zhejiang Cross-straits Food Chain Co. Ltd., Hangzhou, 310018, China)

One new spectrophotometry is set up to test ammonia content in meat used as raw materials with the purpose of evaluating the freshness of the meat. By using P-hydroxybenzoic acid monosodium salt (PHB) as chromogenic agent, the relation between ammonia content and absorbance in the meat has been studied. Results show that to heat for 30minutes in water bath at 37℃, the 1.0mL of meat extract bouillon added with 3.0mL of PHB solution and 1.5mL of sodium hypochlorite solution will turn out fine linear relation between ammonia content and absorbance within 0.00～20.00μ g/25mL when absorbance is measured 695 nm away. Characterized with its high precision and accuracy, sensitiveness, being easy to operate, and low demand for instruments and reagent, the spectrophotometry can be used as an alternative for testing freshness of meat and can be introduced to small and medium meat processing enterprises and used there.

Meat used as raw materials; Ammonia; Freshness; Spectrophotometry

O657.3;TS251.7

A

1671-4326(2016)02-0060-04

10.13669/j.cnki.33-1276/z.2016.040

2016-03-28

2015年度浙江省高等學校國內訪問工程師校企合作項目(137);浙江省大學生科技創新活動計劃(新苗人才計劃)項目20(2016R453001);浙江育英職業技術學院院級課題(YYFW1501)

周紀東(1976-),男,浙江杭州人,浙江育英職業技術學院生物技術系講師,碩士;黃偉(1976-),男,浙江金華人,浙江兩岸食品連鎖有限公司高級工程師,碩士;朱城杰(1993-),男,浙江蕭山人,浙江育英職業技術學院生物技術系畢業生;魏曉玲(1995-),女,浙江海寧人,浙江兩岸食品連鎖有限公司食品檢驗工.