通痹顆粒對佐劑性關節炎大鼠下丘腦—垂體—腎上腺軸及炎癥細胞因子的影響※

柳玉佳　范伏元　王莘智　吳伊瑩　曠惠桃

(湖南中醫藥大學第一附屬醫院風濕病科，湖南　長沙　410007)

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通痹顆粒對佐劑性關節炎大鼠下丘腦—垂體—腎上腺軸及炎癥細胞因子的影響※

柳玉佳范伏元王莘智吳伊瑩曠惠桃△

(湖南中醫藥大學第一附屬醫院風濕病科，湖南長沙410007)

目的觀察通痹顆粒對佐劑性關節炎大鼠下丘腦—垂體—腎上腺(HPA)軸及炎癥細胞因子的影響，為通痹顆粒治療類風濕關節炎(RA)提供實驗依據。方法將40只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、對照組和治療組，每組10只。模型組、對照組及治療組誘導佐劑性關節炎發生。治療組大鼠予通痹顆粒灌胃治療，對照組予雷公藤多苷灌胃治療，連續治療14 d；模型組大鼠參照治療組大鼠進行固定處理，但不予任何治療；空白組不予任何干預。觀察各組大鼠一般情況、關節腫脹度、關節炎指數、下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、血漿促腎上腺皮質激素(ACTH)水平及血清白細胞介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平的變化。結果空白組大鼠皮毛有光澤，色白，精神佳,飲食、活動正常。模型組大鼠皮毛無光澤，色暗，精神差，飲食、活動減少。治療組及對照組大鼠皮毛有光澤，精神可，飲食、活動可。治療前、治療第7、14 d，模型組、對照組及治療組大鼠體質量均低于空白組(P<0.01)。治療第7、14 d，治療組、對照組體質量高于模型組(P<0.05)，治療組體質量高于對照組(P<0.05)。治療前、治療第7、14 d，模型組、對照組及治療組大鼠關節腫脹度高于空白組(P<0.05)。治療第7、14 d，治療組、對照組關節腫脹度、關節炎指數低于模型組(P<0.05)；治療組關節腫脹度、關節炎指數低于對照組(P<0.05)。治療結束后，模型組、對照組及治療組大鼠CRH、ACTH、IL-1及TNF-α均高于空白組(P<0.01)；對照組及治療組CRH、ACTH、IL-1及TNF-α均低于模型組(P<0.05)；治療組CRH、ACTH、IL-1及TNF-α低于對照組(P<0.05)。結論通痹顆粒可以減少炎癥細胞因子的釋放，緩解RA的炎癥，可能與HPA軸的調節作用存在一定的相關性。

關節炎,實驗性；大鼠,Wistar；模型,動物；下丘腦—垂體系統；中藥藥劑學

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以對稱性多關節炎為主要臨床表現的自身免疫性疾病，以關節滑膜的慢性炎癥、關節的進行性破壞為特征[1]。RA在全世界均有發病，平均發病率約為1%，我國大陸地區的患病率約為0.2%～0.4%[2]。目前治療尚無特效藥，大部分患者一旦確診往往需要終身服藥，給患者的工作和生活造成很大的壓力。中醫學以整體觀念、辨證論治為原則，通過長期的、大量的臨床實踐積累了豐富的治療經驗。大量臨床資料顯示，中醫藥在RA的治療中顯示出了極大的優勢[3]，大量藥理研究證實，很多中藥復方或是中藥單體具有改善RA患者癥狀、延緩關節破壞的作用，備受患者青睞[4]。本實驗研究建立佐劑性關節炎大鼠模型，通過觀察通痹顆粒對下丘腦—垂體—腎上腺(HPA)軸及炎癥細胞因子的作用，進一步從現代醫學角度對通痹顆粒治療RA的作用機制進行探討，為通痹顆粒治療RA提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料實驗動物：清潔級Wistar雄性大鼠40只，體質量(160±10) g，由湖南中醫藥大學實驗中心提供，許可證號：SCXK(湘)2009-0004。試劑：促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質激素(ACTH)試劑盒購自北京華英生物技術研究所；白細胞介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2造模將40只Wistar雄性大鼠適應性喂養7 d后，隨機分為空白組、模型組、對照組和治療組，每組10只。空白組大鼠于其右后足跖底部常規皮膚消毒后，用微量注射器皮內注射0.9%氯化鈉注射液0.1 mL于右側后肢足墊皮下；模型組、對照組和治療組大鼠于右后足跖底部常規皮膚消毒后，用微量注射器皮內注射0.1 mL完全弗氏佐劑于右側后肢足墊皮下，誘導佐劑性關節炎發生。

1.3給藥治療組和對照組大鼠利用完全弗氏佐劑誘導24 h后成為佐劑性關節炎大鼠模型后，開始藥物灌胃治療，灌胃劑量按人鼠體表面積折算確定。治療組予通痹顆粒(藥物組成：當歸、白芍藥、黃芪、川芎、全蝎、僵蠶、乳香、沒藥、桂枝、黃柏、甘草，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑科制備，10 g/袋)，將10 g藥物溶于0.9%氯化鈉注射液100 mL，制備成0.1 g/mL溶液，20 g/kg灌胃，根據大鼠體質量換算灌胃容積，每日1次，連續治療14 d。對照組予雷公藤多苷片(浙江普洛康裕天然藥物有限公司，國藥準字Z33020778)，將10 mg藥物溶于0.9%氯化鈉注射液100 mL，制備成0.1 mg/mL溶液，2.4 mg/kg灌胃，根據大鼠體質量換算灌胃容積，每日1次，連續治療14 d。模型組大鼠參照治療組大鼠進行固定處理，但不予任何治療。空白組不予任何干預。

1.4觀察指標

1.4.1一般情況觀察大鼠活動、神態、皮毛、飲食及體質量等情況。

1.4.2關節腫脹度在每只大鼠右后踝關節上同一位置做浸水標記線，運用足跖腫脹度測量儀分別在造模前、治療前、治療第7、14 d測定右后足跖的足跖容積，以總容積變化情況計算大鼠的足跖腫脹度，即為關節腫脹度。

1.4.3關節炎指數根據未注射佐劑的其余3只肢體的病變程度按5級評分法進行累計積分，計算出關節炎指數。0分：無紅腫；1分：小趾關節紅腫；2分：趾關節和足跖腫脹；3分：踝關節以下的足爪腫脹；4分：包括踝關節在內的全部足爪腫脹。將各個關節的積分進行累加，即為每只大鼠的關節炎指數。關節炎指數積分越高，關節癥狀越嚴重。

1.4.4下丘腦CRH實驗結束后，大鼠快速斷頭處死，迅速取下丘腦在0.9%氯化鈉注射液中煮沸5 min；稱質量后，加入1 mol/L氯化氫(HCl)0.8 mL，充分勻漿后室溫下放置100 min；加入1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)0.8～1 mL中和；3 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明進行放射免疫測定。標含量為實測濃度/濕質量。

2　結　果

2.14組大鼠一般情況比較空白組大鼠皮毛有光澤，色白，精神佳,飲食、活動正常。模型組大鼠皮毛無光澤，色暗，精神差，飲食、活動減少。治療組及對照組大鼠皮毛有光澤，精神可，飲食、活動可。體質量變化情況見表1。

表1　4組大鼠體質量變化情況　±s

與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

由表1可見，治療前、治療第7、14 d模型組、對照組及治療組大鼠體質量均低于空白組，差異有統計學意義(P<0.01)。治療第7、14 d，治療組、對照組體質量高于模型組(P<0.05)，治療組體質量高于對照組(P<0.05)。

2.24組大鼠關節腫脹度比較見表2。

表2　4組大鼠關節腫脹度變化比較　±s

與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

由表2可見，治療前、治療第7、14 d模型組、對照組及治療組大鼠關節腫脹度高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。治療第7、14 d，治療組、對照組關節腫脹度低于模型組(P<0.05)，治療組低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。2.33組大鼠關節炎指數比較見表3。

表3　3組大鼠關節炎指數比較　分，±s

與模型組比較，△P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

由表3可見，治療第7、14 d，治療組、對照組關節炎指數低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，治療組關節炎指數低于對照組(P<0.05)。2.44組大鼠治療后下丘腦CRH、血漿ACTH比較見表4。

表44組大鼠治療后下丘腦CRH、血漿ACTH比較

與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

由表4可見，模型組、對照組及治療組大鼠CRH、ACTH均高于空白組，差異有統計學意義(P<0.01)；對照組及治療組CRH、ACTH水平均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組CRH、ACTH低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.54組大鼠治療后血清IL-1、TNF-α比較見表5。

表54組大鼠治療后血清IL-1、TNF-α比較

組 別nIL-1TNF-α空白組1017.03±8.1718.82±5.04模型組1042.36±13.73*46.63±8.23*對照組1029.74±12.58*△35.12±7.51*△治療組1023.33±11.28*△#27.24±6.41*△#

與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

由表5可見，模型組、對照組及治療組大鼠IL-1、TNF-α均高于空白組，差異有統計學意義(P<0.01)；對照組及治療組IL-1、TNF-α水平均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組IL-1、TNF-α低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

3　討　論

近年來, 神經—內分泌—免疫網絡途徑在RA的發病機制中越來越受到重視，并且已經證實，神經內分泌系統對RA發病的免疫調節主要是通過HPA軸實現的，RA的發生發展與HPA軸的功能失調、腎上腺皮質儲備量下降有關[5]。近年來有關RA病因及發病機制的研究也證實，RA患者HPA軸功能下降，可能是滑膜炎癥產生和持續存在的重要因素[6]。在RA炎癥的發生過程中，釋放了大量促炎癥因子如IL-1、TNF-α等，這些炎癥因子刺激HPA軸產生大量皮質醇，促進了RA的發生和發展。

RA屬中醫學痹證、歷節、鶴膝風等范疇，《濟生方》論痹謂：“皆因體虛，腠理空疏，受風寒濕氣而成痹也。”正氣內虛，衛表不固，風寒濕邪自外襲內，營衛不和，經絡痹阻，氣血運行不暢，而形成風寒濕痹。《靈樞·百病始生》謂：“風雨寒熱，不得虛邪，不能獨傷人。卒然逢疾風暴雨而不病者，蓋無虛故邪不能獨傷人，此必因虛邪之風，與其身形，兩虛相得，乃客其形。”故風寒濕邪外侵是痹證發生的重要條件，正氣虧虛是基本內因，治當益氣養血，祛風除濕，通絡止痛。通痹顆粒是湖南中醫藥大學第一附屬醫院治療RA的協定方劑，方中以當歸為君，張介賓在《本草正》中云：“當歸，其味甘而重，故專能補血，其氣輕而辛，故又能行血，補中有動，行中有補，誠血中之氣藥，亦血中之圣藥也。”白芍藥、黃芪為臣，白芍藥與當歸共用，養血調肝，健脾利濕，養血益脾；黃芪與當歸配伍，大補氣血。川芎、全蝎、僵蠶、乳香、沒藥、桂枝、黃柏為佐藥，川芎與當歸、白芍藥共用取四物湯之意，既補血又行血，補血而不滯血，和血而不傷血；全蝎、僵蠶功主鉆透剔邪，搜風通絡、消腫定痛；乳香、沒藥活血化瘀，通絡止痛；桂枝溫通經脈，散寒止痛；反佐黃柏清郁久之熱。甘草為使，調和諸藥。全方共奏益氣養血、祛風除濕之效。現代藥理研究表明，當歸多糖對佐劑性關節炎大鼠原發和繼發性腫脹均有抑制作用，并推斷抑制體液免疫的機制可能是通過其對B細胞的抑制實現[7]；當歸芍藥散對免疫系統具有一定的調節作用,主要增強細胞免疫功能[8]；當歸補血湯可促進小鼠血管內皮生長因子、轉化生長因子等生長因子的表達，發揮一定的免疫調節功能[9-10]；四物湯對機體的免疫及造血功能有一定增強作用，對于免疫系統的功能具有多向調節作用，并可促進吞噬細胞吞噬功能，能使免疫低下脾淋巴細胞產生IL-2的能力恢復正常，從而提高機體耐力[11-12]。

前期研究發現，通痹顆粒能夠顯著降低RA患者血清血管內皮生長因子水平，緩解關節組織的破壞，療效確定且見效快，并能降低血清IL-6水平，療效確切，是治療RA的有效方案[13-14]。本研究中，治療組大鼠皮毛有光澤，精神可，飲食、活動可，通痹顆粒可改善大鼠的生長狀態，增加體質量，優于對照組(P<0.05)；同時，治療第7、14 d，通痹顆粒可改善大鼠的關節腫脹度及關節炎指數，與模型組、對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，表明通痹顆粒對佐劑性關節炎有較好的治療作用。治療后，通痹顆粒能顯著降低下丘腦CRH、血漿ACTH及血清IL-1、TNF-α水平，與模型組、對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，表明通痹顆粒對HPA軸具有一定的調節作用，且具有一定的免疫調節作用。

綜上所述，通痹顆粒可以減少炎癥細胞因子的釋放，緩解RA的炎癥，可能與HPA軸的調節作用存在一定的相關性。但對于具體的調節機制、調節機制中各種激素的內在作用，尚需我們進一步研究。

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(本文編輯：李珊珊)

Effects of Tongbi Granules on hypothalamic-pituitary-gonadal axis and inflammatory cytokines in adjuvant arthritis rats

LiuYujia,FanFuyuan,WangShenzhi,etal.

DepartmentofRheumatology,FirstHospitalAffiliatedtoHunanUniversityofChineseMedicine,Hunan,Changsha410007

ObjectiveTo observe the effects of Tongbi Granules on hypothalamic-pituitary-gonadal axis (HPA) and inflammatory cytokines in adjuvant arthritis rats, and to provide experimental foundation for its treatment of rheumatoid arthritis (RA). Methods 40 Wistar rats were randomly divided into blank, model, control and treatment group, 10 rats in each group. Rats in model, control and treatment groups were induced to adjuvant arthritis rats. The treatment group received Tongbu Granules by gavage, the control group received tripterygium glycosides by gavage, continuously treatment for 14 d. The model group received fixation intervention, and blank group was without any treatment. The general condition, articular swelling degree, arthritis index, corticotropin releasing hormone (CRH), plasma adrenocorticotropic hormone (ACTH), serum interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were observed in all rats. Results Rats in blank group with lustrous fur, white hair color, good spirit, normal appetite and normal activity. Rats in model group with lusterless fur, dark color, poor spirit, reducing diet and less activity. Rats in treatment and control group with lustrous fur, good spirit, normal appetite and normal activity. The body weight before, 7 d and 14 d after treatment in model, control and treatment group were lower than those in blank group (P<0.01). The body weight 7 d and 14 d after treatment in control and treatment group were higher than those in model group (P<0.05), and the body weight in treatment group was higher than that in control group (P<0.05). The articular swelling degree before, 7 d and 14 d after treatment in model, control and treatment group were higher than those in blank group (P<0.05). The articular swelling degree and arthritis index 7 d and 14 d after treatment in control and treatment group were lower than those in model group (P<0.05), and its in treatment group were lower than those in control group (P<0.05). After treatment, the CRH, ACTH, IL-1 and TNF-α in model, control and treatment group were higher than those in blank group (P<0.01), its in control and treatment group were lower than those in model group (P<0.05), and its in treatment group were lower than those in control group (P<0.05).Conclusion Tongbi Granules can decrease inflammatory cytokines release and relief symptom of RA, which may have some correlation with the adjustment of HPA.

Arthritis; Experimental; Wistar; Model; Animal; Hypothalamic-pituitary-gonadal axis; Chinese drugs pharmaceutics

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.07.019

△湖南中醫藥大學第一附屬醫院風濕病科，湖南長沙410007

柳玉佳(1987—)，男，醫師，碩士。主要從事風濕類疾病的中西醫結合診治。

R593.22；R285.5；R335.1

A

1002-2619(2016)07-1029-05

2015-05-20)

※ 項目來源：國家中醫藥管理局2014年全國名老中醫藥專家傳承工作室建設項目