縫隙連接蛋白43與基質(zhì)金屬蛋白酶9在人股動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)分析

王耀磊，周志強(qiáng)，吳成穩(wěn)，李祥波，李飛

（鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 血管外科，河南 鄭州 450014）

論著

縫隙連接蛋白43與基質(zhì)金屬蛋白酶9在人股動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)分析

王耀磊，周志強(qiáng)，吳成穩(wěn)，李祥波，李飛

（鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 血管外科，河南 鄭州 450014）

目的探討縫隙連接蛋白43（CX-43）與基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）在人股動(dòng)脈粥樣硬化（AS）斑塊中的表達(dá)及其與斑塊穩(wěn)定性關(guān)系。方法收集股動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后所得AS斑塊標(biāo)本47例，正常脾動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈組織標(biāo)本21例作為對(duì)照組。根據(jù)術(shù)前彩超及術(shù)后病理檢查結(jié)果進(jìn)行分組：穩(wěn)定斑塊組（22例）和不穩(wěn)定斑塊組（25例），免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)各標(biāo)本中CX-43和MMP-9的表達(dá)以及兩者之間的相關(guān)性。結(jié)果CX-43和MMP-9蛋白在對(duì)照組、穩(wěn)定斑塊組及不穩(wěn)定斑塊組中的表達(dá)均有差異（FCX-43=662.971，F(xiàn)MMP-9=397.716），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。和對(duì)照組比較，斑塊組CX-43和MMP-9表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不穩(wěn)定斑塊組較穩(wěn)定斑塊組CX-43和MMP-9表達(dá)明顯增強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相關(guān)性研究結(jié)果顯示，CX-43和MMP-9在AS組表達(dá)呈正相關(guān)（r穩(wěn)定斑塊組=0.640，P<0.05；r不穩(wěn)定斑塊=0.715，P<0.05），對(duì)照組研究結(jié)果提示CX-43與MMP-9無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)論 CX-43和MMP-9蛋白表達(dá)的上調(diào)促進(jìn)人股動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成以及斑塊組織的不穩(wěn)定性。

動(dòng)脈粥樣硬化；縫隙連接蛋白43；基質(zhì)蛋白酶9

近年來(lái)隨著生活水平的提高、運(yùn)動(dòng)量減少及人口老齡化的加快，動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）發(fā)病率逐年升高，已嚴(yán)重威脅人類健康。下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans，ASO）是AS局部表現(xiàn)，一般表現(xiàn)為間歇性跛行、靜息痛、壞疽甚至面臨截肢風(fēng)險(xiǎn)，因此探究AS病因及發(fā)病機(jī)制、尋找預(yù)防和治療手段、提高生存率、降低截肢率并改善患者生活質(zhì)量意義重大。縫隙連接蛋白43（connexin 43，CX-43）是一種六聚體親水性蛋白，巨噬、平滑肌、血管內(nèi)皮以及成纖維細(xì)胞通過(guò)其達(dá)成信息和物質(zhì)交流，其關(guān)鍵作用點(diǎn)在于促進(jìn)血管內(nèi)皮的損傷、泡沫細(xì)胞形成、平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)遷以及不穩(wěn)定斑塊形成?；|(zhì)蛋白酶9（matrix metall proteinase，MMP-9）又名明膠酶B，主要作用于由膠原、蛋白聚糖及糖蛋白組成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)，從而引起動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的形成、纖維帽破裂、血栓形成等一系列繼發(fā)性病變。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究CX-43和MMP-9在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)情況，探討兩者表達(dá)變化在AS發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制以及可能的治療靶點(diǎn)。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院2013年9月-2015年11月通過(guò)股動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)獲得的股AS斑塊標(biāo)本47例。其中，男性29例，女性18例。另外收集因腹部外傷、門靜脈高壓行脾臟切除術(shù)以及胃腸道手術(shù)獲得完整脾動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈標(biāo)本共21例（對(duì)照組）。其中，男性15例，女性6例。每位患者術(shù)前均已簽署《股AS斑塊手術(shù)標(biāo)本研究知情同意書》，術(shù)中標(biāo)本離體后迅速置于液氮保存，石蠟包埋切片備檢。

1.2標(biāo)本分組及染色

根據(jù)彩超及病理檢測(cè)結(jié)果將收集的標(biāo)本分組，對(duì)照組（21例）、穩(wěn)定斑塊組（22例）及不穩(wěn)定斑塊組（25例），然后常規(guī)進(jìn)行固定、脫水包埋、切片（厚4μm/張）、脫蠟、水化、最后蘇木素-伊紅（HE）染色。

1.3方法與儀器設(shè)備

采用鏈霉菌抗生物素酶蛋白-過(guò)氧化物酶（SP）免疫組織化學(xué)法，具體步驟參照SP試劑盒說(shuō)明書。光學(xué)顯微鏡下觀察股動(dòng)脈斑塊組織和正常動(dòng)脈，可見(jiàn)：以可見(jiàn)棕黃色或棕褐色顆粒作為CX-43和MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。每張圖片取5個(gè)視野進(jìn)行圖像采集，應(yīng)用IPP 6.0測(cè)量計(jì)算所采集切片積分吸光度值，該樣本被測(cè)蛋白的表達(dá)以5個(gè)視野的平均值表示。兔抗人CX-43單克隆抗體、兔抗人MMP-9單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司，切片圖像采集應(yīng)用lecia顯微照相系統(tǒng)（德國(guó)lecia公司），應(yīng)用Biosens Digital Imaging System v1.6（上海山富科學(xué)儀器有限公司）對(duì)所采集切片的陽(yáng)性細(xì)胞積分吸光度值（integral optical density，IOD）進(jìn)行計(jì)算，求出其平均值作為該樣本蛋白陽(yáng)性表達(dá)量。SP900試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物工程有限公司。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，3組間做比較采用單因素方差分析，Bonferroni法兩兩比較，股AS斑塊中CX-43和MMP-9蛋白表達(dá)做相關(guān)性分析時(shí)采用Pearson法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1人股動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病理檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組脾動(dòng)脈和腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞整齊，內(nèi)膜光滑且內(nèi)、中、及外3層膜結(jié)構(gòu)均完整存在。穩(wěn)定斑塊組脂質(zhì)核心區(qū)小于斑塊面積40%，光鏡下內(nèi)皮細(xì)胞紊亂無(wú)序，纖維帽較厚，相對(duì)較少的泡沫及炎癥細(xì)胞及鈣化灶存在；不穩(wěn)定斑塊組脂質(zhì)核心區(qū)較大，超過(guò)斑塊面積40%，內(nèi)皮細(xì)胞排列呈偏心性，較薄的纖維帽，相對(duì)較多的炎癥、泡沫細(xì)胞，斑塊基底部可見(jiàn)大量新生血管和膽固醇結(jié)晶。

2.2股AS斑塊組織、正常動(dòng)脈組織中CX-43與MMP-9表達(dá)比較

MMP-9和CX-43蛋白主要表達(dá)在單核-巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞以及血管平滑肌細(xì)胞中。其中CX-43蛋白在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)及血管分叉處內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)尤其明顯。（見(jiàn)附表、附圖）。

CX-43和MMP-9蛋白表達(dá)：與對(duì)照組比較，斑塊組表達(dá)升高，且兩者在穩(wěn)定斑塊組表達(dá)明顯弱于不穩(wěn)定斑塊組（FCX-43=662.971，P<0.05，F(xiàn)MMP-9=397. 716，P<0.05），（見(jiàn)附表、附圖）。

2.3相關(guān)性分析

CX-43與MMP-9蛋白在穩(wěn)定斑塊組表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.640，P<0.05），不穩(wěn)定斑塊組中也具有正相關(guān)關(guān)系（r=0.715，P<0.05）。

附表　各組標(biāo)本中CX-43與MMP-9蛋白的表達(dá)比較 （）

附表　各組標(biāo)本中CX-43與MMP-9蛋白的表達(dá)比較 （）

注：1）與對(duì)照組比較，P<0.05；2）與穩(wěn)定斑塊組比較，P<0.05

組別MMP-9蛋白對(duì)照組　1.964±0.009穩(wěn)定斑塊組　2.077±0.0311）CX-43蛋白21　1.954±0.082 22　2.061±0.0341）不穩(wěn)定斑塊組　25　2.248±0.0321）2）　2.169±0.0271）2）例數(shù)

附圖　各組標(biāo)本中CX-43和MMP-9蛋白的表達(dá) （SP，×400）

3　討論

AS是動(dòng)脈壁慢性炎癥反應(yīng)過(guò)程[1]，其本質(zhì)是脂質(zhì)沉積、泡沫細(xì)胞生成、內(nèi)膜局灶狀纖維化和粥樣硬化斑塊形成，最終導(dǎo)致一系列繼發(fā)性病變。CX-43是一種六聚體親水性蛋白，巨噬、平滑肌、血管內(nèi)皮以及成纖維細(xì)胞中通過(guò)其達(dá)成信息和物質(zhì)交流，其中CX-43蛋白與AS關(guān)系最密切，血流剪切力較大部位如血管分叉處表達(dá)尤其明顯[2]，內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子以及血管活性物質(zhì)分泌失調(diào)，進(jìn)而引起平滑肌增殖和遷徙[3]。平滑肌細(xì)胞以表型轉(zhuǎn)化方式通過(guò)內(nèi)彈力膜向內(nèi)膜增生和遷徙，后經(jīng)受體介導(dǎo)的方式吞噬脂質(zhì)，肌源性泡沫細(xì)胞形成，以上過(guò)程均體現(xiàn)在國(guó)外學(xué)者研究中。平滑肌細(xì)胞增生遷徙形成粥樣斑塊纖維帽，同時(shí)細(xì)胞中CX-43表達(dá)上調(diào)，該結(jié)果提示CX-43過(guò)表達(dá)在平滑肌增生和遷徙過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附，由中膜內(nèi)遷至內(nèi)膜后，轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞并經(jīng)受體介導(dǎo)吞噬大量氧化變性的低密度脂蛋白，大量膽固醇被攝入，單核源性泡沫細(xì)胞形成[4-6]，該過(guò)程往往發(fā)生在血管內(nèi)皮損傷或炎癥反應(yīng)后。國(guó)外學(xué)者對(duì)AS發(fā)病機(jī)制研究后發(fā)現(xiàn)，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞采用選擇性敲除CX-43基因等手段，可減少黏附分子表達(dá)，進(jìn)而減少單核-內(nèi)皮細(xì)胞的黏附與遷徙[7]。大量氧化低密度脂蛋白在巨噬細(xì)胞釋放活性氧后生成，進(jìn)而使平滑肌源、單核細(xì)胞源泡沫細(xì)胞均崩解壞死，形成糜粥樣壞死物。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CX-43通過(guò)Ras基因家族的RhoA影響巨噬細(xì)胞的胞吞作用，因而間接證實(shí)巨噬細(xì)胞攝取氧化低密度脂蛋白的增多由CX-43表達(dá)增多所致[8]。另外由巨噬細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶激活后具有生物活性，分解基質(zhì)削薄粥樣硬化纖維蛋白帽，是不穩(wěn)定斑塊的形成、纖維帽的破裂及血栓形成的主要原因。

MMP-9又名明膠酶B，是具有Zn2+離子依賴性的肽鏈內(nèi)切酶，主要作用于由膠原、蛋白聚糖及糖蛋白組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)。MMP-9首先以無(wú)活性酶原的形式分泌到細(xì)胞外，CatS將其前驅(qū)肽鏈水解，封閉Zn2+活性中心的半胱氨酸脫離，MMP-9激活完成，MMP-9活化后可降解細(xì)胞外基質(zhì)重要組成成分，基膜IV型膠原，引起斑塊ECM降解大于合成[9]，進(jìn)而導(dǎo)致血管壁屏障破壞，其與單核、平滑肌細(xì)胞增生和內(nèi)遷、低密度脂蛋白的沉積關(guān)系密切，另外分解基質(zhì)削薄粥樣硬化纖維蛋白帽，是不穩(wěn)定斑塊的形成、纖維帽的破裂及血栓形成的主要原因[10]。國(guó)外學(xué)者對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化致頸動(dòng)脈狹窄患者抽血研究表明，MMP-9在不穩(wěn)定斑塊組患者血漿中表達(dá)明顯，進(jìn)一步證實(shí)MMP-9致斑塊不穩(wěn)定作用[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，CX-43和MMP-9表達(dá)量在斑塊組較高，且兩者在穩(wěn)定斑塊組表達(dá)明顯弱于不穩(wěn)定斑塊組，同時(shí)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在AS形成過(guò)程中兩者正相關(guān)，且就相關(guān)系數(shù)（r）而言穩(wěn)定斑塊組明顯低于不穩(wěn)定斑塊組，以上結(jié)果均提示CX-43和MMP-9蛋白與AS疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。有國(guó)外學(xué)者研究表明激活的單核細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)CX-43構(gòu)建的縫隙連接通道而釋放基質(zhì)金屬蛋白酶[12]，該結(jié)論正好與本實(shí)驗(yàn)中CX-43與MMP-9正相關(guān)相符?？p隙連接的建立來(lái)源于CX-43的高表達(dá)，單核細(xì)胞激活后通過(guò)該通道，以電信號(hào)、化學(xué)信號(hào)的的形式將信息傳遞至周圍細(xì)胞，從而引起單核細(xì)胞的瀑布效應(yīng)，導(dǎo)致更多的MMP-9形成，最終以不穩(wěn)定斑塊的形成、纖維帽的破裂、以及血栓的形成結(jié)局。

綜上所述，股AS的形成是多方面原因共同作用結(jié)果，抑制或者拮抗CX-43與MMP-9的表達(dá)可減緩AS發(fā)展、增加斑塊穩(wěn)定性，以上這些都為臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化提供了新思路及治療靶點(diǎn)。

[1]蔣米爾,趙振.動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)與展望[J].中華實(shí)驗(yàn)外科學(xué)雜志,2014,31(4):699-701.

[2]BRISSET A C,ISAKSON B E,KWAK B R.Connexins in vascular physiology and pathology[J].Antioxid Redox Signal,2009, 11(2):267-282.

[3]LI I,DAI M.The cause of atherosclerosis:secretory dysfunction in vascular endothelial cells and proliferation of smooth muscle cells[J].Chin Pharmacol Bull,2010,26(2):155-158.

[4]LEGEIN B,TEMMERMAN L,BIESSEN E A,et al.Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis[J].Cell Mol Life Sci,2013,70(20):3847-3869.

[5]TEDGUI A,MALLAT Z.Cytokines in atherosclerosis:pathogenic and regulatory pathways[J].Physiol Rev,2006,86(2):515-581.

[6]YUAN D,WANG Q,WU D A.Monocyte-endothelial adhesion is modulated by CX-43-stimulated ATP release from monocytes[J]. Biochem Biophys Res Commun,2012,420(3):536-541.

[7]KWAK B R,VEILLARD N,PELLI G A.Reduced connexin 43 expression inhibits atherosclerotic lesion formation in low-density lipoprotein receptor-deficient mice[J].Circulation,2003,107(7): 1033-1039.

[8]ANAND R J,DAI S,GRIBAR S A.A role for connexin 43 in macrophage phagocytosis and host survival after bacterial peritoneal infection[J].J Immunol,2008,181(12):8534-8543.

[9]吳成穩(wěn),周志強(qiáng),王耀磊,等.基質(zhì)蛋白酶-9及組織蛋白酶S在人股動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)[J].中華實(shí)驗(yàn)外科學(xué)雜志,2015,32 (5):1137-1139.

[10]ARMSTRONG E J,MORROW D A,SABATINE M S.Inflammatory biomarkers in acute coronary syndromes:part IV:matrix metalloproteinases and biomarkers of platelet activation[J].Circulation,2006,113(1):382-385.

[11]ALVARET B,RUIZ C,CHACON P,et al.Serum values of metalloproteinase-2 and metalloproteinase-9 as related to unstable plaque and inflammatory cells in patients with greater than 70%carotid artery stenosis[J].J Vasc Surg,2004,3(40): 469-475.

[12]EUGENIN E A,BRANES M C,BERMAN J W,et al. TNF-alpha plus IFN-gamma induce connexin 43 expression and formation of gap junctions between human monocytes/macrophages that enhance physiological responses[J].J Immunol,2003,170(1):1320-1328.

（張蕾編輯）

Expression of CX-43 and MMP-9 in atherosclerotic p laques of human femoral artery

Yao-leiWang，Zhi-qiang Zhou，Cheng-wen Wu，Xiang-bo Li，F(xiàn)ei Li
（Department of Vascular Surgery，the Second Affiliated Hospital Of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450014，China）

Objective To discuss the expression levels of CX-gap junction protein 43（CX-43）and matrix metalloproteinase 9（MMP-9）in atherosclerotic plaques of human femoral artery，and their correlations with the stability of the plaques.M ethods Totally 68 specimens were collected，of which 47 atherosclerotic plaque specimens were from patients who underwent femoral artery endarterectomy（experimental group）and 21 specimens were from normal splenic artery or superiormesenteric artery（control group）.Then the47 atherosclerotic plaque specimens were divided into stable-plaque group（22 cases）and unstable-plaque group（25 cases）according to ultrasonography and pathological results.Using immunohistochemical SP method the expression levels of the CX-43 and the MMP-9 were detected，and their relationship was investigated.Results There were significant differences in the expression levels of CX-43 and MMP-9 among the control group，the stable plaque group and the unstable plaque group（FCX-43=662.971，P＜0.05；FMMP-9=397.716，P＜0.05）.Compared with the control group，the expression levels of CX-43 and MMP-9 in the atherosclerosis group were significantly increased（P＜0.05）.The expression levels of CX-43 and MMP-9 in the unstable plaque group were significantly higher than those in the stable plaque group（P＜0.05）.The result of the correlation research showed that the expression levels of CX-43 and MMP-9 in the atherosclerosis groups were positively correlated（rstable=0.640，P＜0.05；runstable=0.715，P＜0.05），but they had nosignificant correlation in the control group.Conclusions Up-regulation of CX-43 and MMP-9 protein expressions could promote the formation of atherosclerosis plaques in human femoral artery and cause instability of the plaque tissue.

atherosclerosis；CX-gap junction protein 43；martix metalloproteinase 9

R 654.3；R 543.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.010

1005-8982（2016）14-0048-04

2016-01-26

周志強(qiáng)，E-mail：qiang6364@sohu.com；Tel：13937104760