雌激素受體α、雌激素受體β、激活蛋白1、血管內皮生長因子在大鼠子宮內膜異位癥模型中的表達及意義*

李鵬程，劉玉玲，黨群，劉慧麗，王冬亮，湯福想，郭沛沛，劉學友

（1.鄭州大學第二附屬醫院 婦產科，河南 鄭州 450014；2.河南省人民醫院，河南 鄭州 450003）

論著

雌激素受體α、雌激素受體β、激活蛋白1、血管內皮生長因子在大鼠子宮內膜異位癥模型中的表達及意義*

李鵬程1，劉玉玲1，黨群2，劉慧麗2，王冬亮1，湯福想1，郭沛沛1，劉學友1

（1.鄭州大學第二附屬醫院 婦產科，河南 鄭州 450014；2.河南省人民醫院，河南 鄭州 450003）

目的探討雌激素受體α（ERα）、雌激素受體β（ERβ）、激活蛋白1（AP-1）、血管內皮生長因子（VEGF）在大鼠子宮內膜異位癥（EM s）模型中的表達及意義。方法采用皮下種植法建立大鼠EM s模型，選取建模成功的28只大鼠為模型組（n=28），觀察大鼠EMs模型在位內膜及異位病灶的組織病理學改變，并通過免疫組織化學法檢測對照組子宮內膜、模型組在位子宮內膜和異位病灶ERα、ERβ、AP-1、VEGF的表達情況。結果①大鼠EM s模型在位內膜及異位病灶腺體、間質血管明顯增加；②大鼠EMs模型的異位病灶與對照組子宮內膜間ERα陽性率比較，差異無統計學意義（P=0.107），而其在位內膜中的表達較對照組比較，差異有統計學意義（P<0.01）。ERβ、AP-1（c-jun）蛋白、VEGF在模型組在位內膜及異位病灶中陽性率與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.01），但其在位內膜及異位病灶中的表達比較，差異無統計學意義。結論大鼠EM s模型在位內膜中ERα和ERβ均高表達，異位病灶中則僅表現為ERβ高表達，同時上調c-jun，VEGF的表達，ERβ可能在EM s的發生發展中起到較ERα更為重要的作用。

子宮內膜異位癥；動物模型；雌激素受體亞型；激活蛋白1

子宮內膜異位癥（Endometriosis，EMs）是一種雌激素依賴性疾病，嚴重影響育齡期婦女的生活質量及生育能力。關于其發病機制，SAMPSON最先提出經血逆流學說，而后郎景和院士提出“在位內膜決定論”[1]認為EMs的在位子宮內膜與非子宮內膜異位癥存在本質上的不同。其分子生物學行為可能源于雌激素暴露，作用于雌激素受體（estrogen receptor，ER），啟動對應的信號通路，多條信號通路相互作用的結果促進了逆流的子宮內膜在宮腔以外生長。激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）是一種重要的核轉錄調控因子，參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生理過程，雌激素與ER結合后，依賴ER轉導通路，調節轉錄因子（如AP-1、NF-кB）的活性，進而調控相應細胞因子的表達，促進EMs的形成和發展。大量研究證據顯示，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在EMs的發生發展中有重要作用，但與有關信號傳導途徑的研究結果尚不明確。本研究通過建立大鼠EMs模型，應用免疫組織化學檢測正常大鼠子宮內膜、大鼠EMs模型異位病灶及在位子宮內膜中ERα，ERβ，AP-1（c-jun蛋白）、VEGF的表達，探討雌激素受體亞型、AP-1、VEGF在大鼠EMs模型中的表達特點及意義。

1　材料與方法

1.1材料來源

河南省動物實驗中心購買的清潔健康雌性未孕的SD大鼠60只。鼠齡60～90 d，體重220～250 g，實驗的各研究組大鼠的鼠齡、質量之間均無明顯差異。兔抗大鼠ER α、ER β、c-jun、VEGF多克隆抗體，免疫組織化學試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1構建大鼠EM s模型觀察大鼠的正常發情周期，選取連續觀察2個正常發情周期的大鼠進行建模。建模前1天均肌注苯甲酸雌二醇0.2mg/（kg· d），使大鼠處于發情期，皮下移植法建立子宮內膜異位癥的動物模型[2]。具體方法：供體大鼠稱重，10%水合氯醛（0.3ml/100 g）腹腔麻醉，固定，常規腹部備皮，消毒鋪巾，取尿道口上方大概10mm處行約3 cm的垂直正中縱切口開腹進入腹腔，在膀胱下可見子宮呈“Y”形，近端在離宮角約10mm處結扎，遠端在離卵巢約20mm處結扎，切除子宮，放入磷酸鹽緩沖液中洗滌，切開管形子宮，剝除漿膜層、肌層，將剝除的子宮內膜剪為5mm×5mm大小的片段；采用皮下種植法將子宮內膜片段植入受體大鼠的腹肌和皮下筋膜之間，使內膜面緊貼腹肌進行皮下建模術，同時取部分內膜組織送病理檢查以確認為大鼠子宮內膜組織，最后關腹。術后3 d常規進行硫酸慶大霉素0.1ml肌肉注射預防感染。術后常規喂養3周，進行2次開腹，觀察移植子宮內膜（異位病灶）的生長情況。構建模型成功的標準：病理組織學證明為大鼠子宮內膜組織，移植物呈囊性生長增大，囊壁有新鮮血管形成、少許結締組織，囊泡內有清亮或黃色液體。

1.2.2實驗分組及標本處理隨機選取同一批次10只正常雌性大鼠作為對照組（喂養條件與術后實驗組相同），選取建模成功的大鼠28只（2只為無效造模）作為實驗組，在消毒、無菌條件下取模型組大鼠異位病灶組織、在位子宮內膜及對照組子宮內膜，分別固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋，將蠟塊連續切片，厚4μm，部分常規蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，部分用免疫組織化學法檢測ER α，ER β，AP-1（c-jun蛋白）、VEGF的表達情況。

1.2.3免疫組織化學檢測及結果判定采用免疫組織化學鏈霉親和素 -生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）法，本實驗中用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗，呈陰性，嚴格按照試劑盒操作說明進行，脫蠟、滅活內源性酶、封閉，一抗、二抗反應后二氨基聯苯胺顯色并脫水后鑲埋，充分干燥后采用半定量標準判定免疫組織化學的陽性結果：每個石蠟標本取4張切片，每張切片鏡下隨機取5個（×400）視野，綜合染色強度及細胞核中陽性細胞的百分比進行判定，抗體效應物為棕褐色或棕黃色。陽性細胞染色深度評分標準：淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞所占比例評分標準：1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；兩者乘積≥3分為陽性，各組所有視野的平均分作為最終的評定標準，計算各組的陽性率。

1.3統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計數資料用百分比或率表示，用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠EMs組織病理學特征

大鼠EMs模型異位病灶呈囊性生長增大，囊壁有新鮮血管形成、少許結締組織，囊泡內有清亮或黃色液體。組織病理學可見異位子宮內膜腺體生長良好，分散排列，囊腔可見炎癥細胞，間質富含血管，固有腺體較多，呈擴張狀改變。腺體數目較在位內膜少。見圖1。（異位病灶鏡下見較多脂肪組織因皮下建模的緣故）。

2.2對照組、模型組在位子宮內膜及異位病灶中ER α、ER β、c-jun、VEGF蛋白的表達

免疫組織化學結果顯示ER α、ER β、c-jun、VEGF在大鼠子宮腺上皮細胞、腔上皮細胞及間質細胞內均有表達，其中以腺上皮細胞表達顯著，陽性表達呈棕色顆粒。整體來說ER α比ER β表現出更明顯的陽性率，均表現為棕褐色或棕黃色顆粒。ER α在模型組在位子宮內膜中的表達及ER β、c-jun、VEGF在在位子宮內膜和異位病灶中的表達均較對照組明顯增強（P<0.01），但ER α在異位病灶中的表達與對照組比較，差異無統計學意義（P> 0.05），各因子在模型組異位病灶及在位子宮內膜間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2～5和表1～4。

圖1　建模成功的大鼠子宮內膜異位病灶及在位內膜的組織病理學特征（HE×100）

圖2　ER α在各研究組中的表達（SABC×400）

圖3　ER β在各研究組中的表達（SABC×400）

圖4　c-jun在各研究組中的表達（SABC×400）

圖5　VEGF在各研究組中的表達（SABC×400）

表1　ER α蛋白在兩組大鼠子宮內膜中的表達情況

表2　ER β蛋白在兩組大鼠子宮內膜中的表達情況

表3　c-jun蛋白在兩組大鼠子宮內膜中的表達情況

表4　VEGF蛋白在兩組大鼠子宮內膜中的表達情況

3　討論

3.1ER α、ER β與EMs的相關性

EMs是一種雌激素依賴性疾病，雌激素與ER結合促進了異位內膜的侵襲、生長，且造成子宮內膜細胞特殊的生物學性質，郎景和院士提出“在位內膜決定論”[1]，認為EMs的在位子宮內膜具有更強的侵襲、黏附、血管形成特性，與正常子宮內膜有明顯差異，可隨經血逆流入腹腔并極易種植生長，引起EMs的發生發展。

隨著ERβ的發現，證明雌激素是通過ER α、ER β發揮調節作用[3]，本研究中模型組在位內膜中ERα、ERβ的表達均較對照組顯著，異位病灶中ERα的表達未表現出差異，ERβ的表達模型組較對照組顯著，驗證了“在位內膜決定論”。模型組異位病灶ERβ的表達顯著，ER α/ER β比值降低，這與HUDELIST等[4]研究結果一致，異位病灶中ERβ的表達明顯增強，ERα的表達相對較弱。有報道ERα在卵巢子宮內膜異位癥的在位內膜中表達顯著，認為其是卵巢子宮內膜異位癥形成和發展的關鍵[5]，而另有報道異位病灶中ERα的周期性改變不明顯，甚至消失，ERβ的改變在異位病灶中起主要作用[6-7]，本研究證實，在正常子宮內膜、EMs在位子宮內膜及異位病灶中ERα的表達較ERβ強，但只有EMs在位內膜與對照組的比較中ERα的表達差異有統計學意義，其余未顯示差異有統計學意義，而ERβ在EMs的異位病灶和在位內膜中表達明顯增強，據此推測，ERα是EMs發生的重要前提條件，ERβ決定EMs發生的結局，在位內膜ERα、ERβ的顯著表達、異位病灶ERα/ERβ比值的下降，這種表達模式的改變，是促進EMs發生、發展的重要條件，ERβ在EMs的發生、發展中可能起到較ERα更為重要的作用，但是ERα、ERβ間是否存在相互作用以及其復雜的作用機制需要更深入的研究。

3.2ERα、ERβ與AP-1、VEGF的相互作用關系

雌激素作用于ER，通過ER信號轉導通路對AP-1進行激活、調控。ER信號轉導通路有兩種：①基因轉錄效應；②非基因轉錄效應：雌激素與ER結合后，主要依賴絲裂原激活蛋白激酶信號傳導途徑，調節相關轉錄因子（NF-кB、AP-1等）的表達。高雌激素環境、ER的亞型、組織細胞的類型對AP-1的表達起著重要的作用，與EMs的發生發展關系密切[8]。VEGF在EMs中過表達，促進血管生成、異位內膜細胞增殖，促進子宮內膜細胞黏附、侵襲、血管形成。雌激素作用于ER，VEGF的表達明顯增強[9]，同時發現其啟動子內包含AP-1的結合位點[10]，AP-1被激活后，作用于VEGF的轉錄位點，增強VEGF的表達。本實驗中在位內膜ERα、ERβ的顯著表達、異位病灶ERα/ERβ比值的下降，AP-1的異常激活，VEGF的顯著上調，提示雌激素可能主要作用于ERβ，激活、調控AP-1，上調VEGF，促進EMs的發生、發展。但具體哪一種雌激素作用通路對AP-1進行調控，上調VEGF，需要進一步研究證實。另外ERβ、c-jun、VEGF在大鼠EMs模型的在位內膜和異位病灶子宮內膜的無差異表達，也更證實“在位內膜決定論”的觀點。

綜上所述：EMs的發病機制尚在研究中，存在頗多爭議，雌激素受體表達模式的改變是EMs形成的一個重要方面。目前第3代雌激素受體調節劑巴多昔芬作為治療EMs的新藥逐漸進入人們的視野[2]，對ERα、ERβ及其作用通路及ERα、ERβ間復雜的作用機制進行研究，將為EMs的發病機制及臨床靶向治療提供理論依據。

[1]郎景和.子宮內膜異位癥發病的“在位內膜決定論”.中華醫學會.第八次全國婦產科學學術會議論文匯編[C].中華醫學會,2004:2.

[2]呂會娟,劉玉玲,黨群,等.巴多昔芬對大鼠子宮內膜異位癥的作用及機制[J].中華婦產科雜志,2015(4):291-295.

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[4]HUDELIST G,KECKSTEIN J,CZERWENKA K,et al.Estrogen receptor beta and matrix metalloproteinase 1 are coexpressed in uterine endometrium and endometriotic lesions of patients with endometriosis[J].Fertil Steril,2005,84(2):1249-1256.

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（張蕾編輯）

Expression and significance of estrogen receptors α and β，activator protein and VEGF in rat model of endometriosis*

Peng-cheng Li1，Yu-ling Liu1，Qun Dang2，Hui-li Liu2，Dong-liang Wang1，Fu-xiang Tang1，Pei-pei Guo1，Xue-you Liu1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450014，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou，Henan 450003，China）

Objective To explore the expression and significance of estrogen receptor α（ERα），ER β，activator protein 1（AP-1）and VEGF in rat model of endometriosis（EM）.M ethods Subcutaneous implantation was used to establish EM model in female rats.The rats with successful ectopic implants were served as model group（n=28），and the normal rats served as control group（n=10）.The histopathological changes of ectopic implants were observed after fourweeks.The expression levels of ERα，ERβ，AP-1 and VEGF in the endometrium and endometriosis lesions were observed by immunohistochemistry in the two groups.Results There were more glands and blood vessels in the stroma of endometriosis lesions and the endometrium of the model group.There was no statistically significant difference in ER α expression level between the endometriosis lesions of the EM model and the endometrium of the control group（P=0.107），but its expression level in the endometrium of the model group was obviously increased compared with the control group（P＜0.01）.The expression levels of ERβ，AP-1 and VEGF inthe endometriosis lesions and endometrium of the EM model were obviously increased compared with those of the control group（P＜0.01），but there was no statistically significant difference between the endometriosis lesions and endometrium of the EM model.Conclusions ER α and ER β are obviously increased in the endometrium of the EM rat model；but in the endometriosis lesions，only ER β is significantly increased.Moreover，the expressions of AP-1 and VEGF are up-regulated in the EM model.ER β may play a more important role than ER α in the occurrence of endometriosis.

endometriosis；animal model；estrogen receptor subtype；activator protein 1

R-332；R711.71

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.14.002

1005-8982（2016）14-0007-05

2016-04-06

河南省衛生科技中青年創新人才工程資助項目（No：201004122）

劉玉玲，E-mail：zzlyl63@163.com