福建沿海米氏凱倫藻赤潮對皺紋盤鮑鰓組織抗氧化酶活性的影響研究

林佳寧, 顏 天, 張清春, 王云峰, 劉 青, 周名江

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福建沿海米氏凱倫藻赤潮對皺紋盤鮑鰓組織抗氧化酶活性的影響研究

林佳寧1, 2, 顏 天1, 張清春1, 王云峰1, 劉 青1, 周名江1

(1. 中國科學院 海洋研究所, 海洋生態與環境科學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國環境科學研究院 流域水生態保護技術研究室, 北京 100012)

本文初步研究了在較低赤潮密度(低于107個/mL)下, 一株米氏凱倫藻()對皺紋盤鮑()鰓內幾種抗氧化酶, 如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)的毒性效應, 以期分析米氏凱倫藻對鮑魚生命活動可能的脅迫方式。研究表明, 米氏凱倫藻對SOD、CAT酶活性均造成不利影響, 并未對GSH-Px酶造成不利影響, 其酶活性顯著高于對照組。米氏凱倫藻對SOD酶活性的影響表現為“先誘導后抑制”效應, 24 h內, 各處理組(0.1個/mL, 0.5個/mL, 1.0×104個/mL)中, 酶活性急劇增高, 分別是對照組的1.2, 1.3, 1.3倍, 之后酶活性迅速下降, 分別是對照組的77%, 77%, 73%。SOD能夠清除機體體內多余的自由基, 其活力變化反映了機體抵制自由基損傷能力已受到明顯抑制。此外, 米氏凱倫藻處理組中, CAT酶活性則處于“被抑制”狀態, 48 h內酶活性持續下降, 分別降低至對照組的58%, 51%, 37%。CAT可以清除SOD歧化超氧陰離子自由基產生的H2O2, 其活力的下降也可能造成機體內過氧化物的累積及氧化損傷。結果表明, 即使未達到較高赤潮密度(不超過107個/mL)時, 米氏凱倫藻短時間內仍可對鮑魚鰓內關鍵抗氧化酶活性造成顯著抑制效應, 這極有可能導致鮑魚機體抗氧化系統遭受嚴重損傷。

米氏凱倫藻(); 皺紋盤鮑(); 鰓; 抗氧化酶; 酶活性

2012年春夏季(5月至6月), 福建近岸海域發生多起大規模的米氏凱倫藻()赤潮災害, 赤潮發生期間, 米氏凱倫藻藻細胞密度高達107個/L, 部分海域赤潮持續時間長達21 d。該赤潮造成海上養殖鮑魚大面積死亡, 對平潭、惠安、福清、莆田、福州等地鮑魚養殖業危害嚴重[1], 造成總經濟損失達20.11億元[2], 為世界上目前報道的赤潮經濟損失之最。

米氏凱倫藻赤潮在世界沿海廣泛存在, 是一類典型的魚毒性赤潮, 能在幾小時之內造成魚類大量死亡。然而, 2012年福建沿海的米氏凱倫藻赤潮卻對鮑魚造成了巨大的殺傷性, 引起了普遍的關注。已有研究表明, 米氏凱倫藻對貝類生命活動能產生一定的影響, 如導致紫貽貝、長牡蠣清濾率下降[3]; 降低海灣扇貝D形幼蟲的活力; 導致底棲貽貝、牡蠣、蛤類的死亡等[4-7]。2012年米氏凱倫藻赤潮作為鮑魚的“殺手”, 室內研究表明, 較高的赤潮密度下(2.0, 3.0×104個/mL), 米氏凱倫藻可導致鮑魚48 h內死亡率高于50%, 然而, 米氏凱倫藻對鮑魚生命活動的脅迫方式如何, 目前仍鮮有研究。

以往研究發現, 許多有害甲藻, 如鏈狀裸甲藻、塔瑪亞歷山大藻等可以導致貝類組織內抗氧化酶系的活性改變, 致使動物機體因活性氧過量積累而對生物體造成損傷, 甚至死亡[8-10]。活性氧會引起生物體內酶變性、多聚糖解聚、DNA損傷, 進而導致遺傳改變[11], 還可能導致脂類分子過氧化, 從而破壞生物膜的完整性。已有研究表明, 米氏凱倫藻可以產生超氧陰離子和過氧化氫, 能夠通過氧化細胞膜的膜脂, 對生物造成氧化損傷[12]。因此, 米氏凱倫藻赤潮發生時, 其是否會對鮑魚機體造成氧化損傷, 目前尚不清楚。

生物體的抗氧化防御系統在清除活性氧物質, 減少細胞氧化損傷方面發揮著重要作用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-PX)被認為是水生生物體內去除活性氧的最重要的酶類[13]。在水生動物中, 鰓是水體污染物發揮毒性作用的最初位點, 具有氣體交換、離子和酸堿調節、氮排泄以及解毒功能。本文通過室內實驗, 模擬了較低赤潮密度下(不超過107個/L), 米氏凱倫藻對皺紋盤鮑鰓抗氧化酶系的影響, 力求分析米氏凱倫藻對皺紋盤鮑生命活動可能的脅迫方式。

1 材料與方法

1.1 材料

米氏凱倫藻()由廈門大學王大志教授課題組提供, 分離自2012年福建米氏凱倫藻赤潮發生區域, 以f/2培養液單種培養, 光暗比為14L︰10D, 光照強度約為3000 lx。用于藻類培養與實驗的海水為來自青島第二海水浴場經沙濾過后的自然海水, 使用前經0.45 μm混合纖維濾膜過濾并高溫消毒, 水溫19℃±0.5℃, 鹽度30±1。供試實驗動物皺紋盤鮑由青島市膠南福海生海珍品有限公司提供, 經篩選后選規格一致的幼鮑(殼長: 2.0~2.5cm)在實驗室內100 L海水水槽中暫養7 d, 暫養期間充分曝氣, 每天投喂新鮮海帶。用于鮑魚室內暫養的海水未經0.45 μm混合纖維濾膜過濾與高溫消毒, 其他條件與藻類培養海水一致。

1.2 方法

實驗容器為3 L玻璃燒杯, 實驗體積為2.5 L。取指數生長中期的藻液, 0.5 mL計數框計數后用海水稀釋, 使藻細胞數量分別達到預設梯度(0.1個/mL, 0.5個/mL, 1.0×104個/mL), 以無菌海水作為實驗藻液的空白對照。挑選暫養后健康的幼鮑隨機加入燒杯中, 每杯10只, 將稀釋好的藻液加入到燒杯, 每個處理組包含9個平行。實驗在恒溫條件下進行, 溫度為19℃±0.5℃, 鹽度30±1, 實驗過程中進行均勻曝氣處理( DO濃度7.0~8.0 mg/L), pH為7.5~8.2, 水體中氨氮濃度為0.004~0.084 mg/L(能維持貝類正常生存)。實驗持續48 h, 每隔24 h更換一次培養液, 以保證較為準確的藻濃度, 實驗中未給鮑魚投喂餌料。同時, 觀察鮑魚的存活情況, 幼鮑中毒后多次刺激無反應判斷為死亡, 并從燒杯中撈出。實驗第0, 24, 48 h時采樣, 每個處理組隨機采集9只鮑魚, 分離出鰓樣品, 用蒸餾水沖洗干凈后置于凍存管中, 于–80℃超低溫冰箱中保存。樣品測定前解凍, 加入預冷的磷酸緩沖液(比例1︰9), 冰浴中勻漿, 之后4℃離心30 min, 5000 r/min, 取上清液進行酶活性分析。

SOD、CAT、GSH-Px酶活性測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒, 嚴格按照試劑盒說明書進行。SOD活性單位定義為: 每毫克組織蛋白中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U)。CAT活性單位定義為: 每毫克組織蛋白每秒鐘分解1μmol的H2O2的量為一個活力單位。GSH-Px活性單位定義為: 規定每毫克組織蛋白在37℃反應5 min, 扣除非酶促反應作用, 使反應體系中GSH-Px濃度降低1mol/L為一個酶活力單位。蛋白含量采用考馬斯亮藍方法進行測定。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel 2010、SPSS 16.0以及ORIGIN 8.5軟件進行統計分析和作圖, 利用ANOVA進行統計檢驗, 顯著性檢驗的置信度水平為0.05。

2 實驗結果

2.1 米氏凱倫藻對皺紋盤鮑48h內存活率的影響

圖1為不同藻細胞密度下(0.1個/mL, 0.5個/mL, 1.0×104個/mL)米氏凱倫藻對皺紋盤鮑48 h內存活率的影響。結果表明, 48 h內, 各個處理組鮑魚均保持較高的存活率。0.1個/mL、0.5×104個/mL米氏凱倫藻處理組中, 鮑魚存活率高達100%, 未出現死亡現象。1.0×104個/mL米氏凱倫藻處理組中, 鮑魚48 h內存活率仍接近80%。

2.2 米氏凱倫藻對皺紋盤鮑48h內SOD酶活性的影響

圖2為不同米氏凱倫藻藻細胞密度下, 皺紋盤鮑48h鰓內SOD酶活性的變化, SOD酶活性表現為先升高后降低的趨勢。24h時, 各個密度米氏凱倫藻(0.1個/mL, 0.5個/mL, 1.0×104個/mL)處理組中, SOD酶活性均顯著高于對照組(<0.05), 分別增高至對照組的1.24, 1.29, 1.33倍, 表明此時酶活性一直處于被誘導狀態。48 h時, SOD酶活性顯著下降(<0.05), 分別降至對照組的77.34%, 77.41%, 72.82%, 表明此時酶活性處于明顯被抑制的狀態。由此說明, 較短時間內(48 h), 米氏凱倫藻雖對鮑魚存活率影響不大, 但可顯著抑制鮑魚鰓內SOD酶活性, 造成機體氧化損傷。

2.3 米氏凱倫藻對皺紋盤鮑48h內CAT酶活性的影響

圖3 為不同藻細胞密度下, 米氏凱倫藻對皺紋盤鮑48 h內CAT酶活性的影響。48 h內, 各個密度米氏凱倫藻(0.1個/mL, 0.5個/mL, 1.0 ×104個/mL)處理組中, CAT酶活性顯著低于對照組(<0.05), 且隨時間延長, CAT酶活性持續下降。48 h時, CAT酶活性分別降至與對照組的58.24%, 51.37%, 37.42%, 由此說明, 米氏凱倫藻(0.1~1.0×104個/mL)短時間內, 能夠顯著抑制鮑魚鰓內CAT酶活性。

2.4 米氏凱倫藻對皺紋盤鮑48h內GSH-Px酶活性的影響

圖4 為不同藻細胞密度下, 米氏凱倫藻對皺紋盤鮑48h內GSH-Px酶活性的影響。各米氏凱倫藻處理組中, GSH-Px酶活性均表現持續升高的趨勢。實驗過程中, 各處理組內GSH-Px酶活性顯著高于對照組(<0.05), 表明GSH-Px酶活性一直處于被誘導狀態。48 h時, 各處理組中GSH-Px酶活性增至最高值, 分別為對照組的1.73倍、1.58倍、1.76倍。由此說明, 米氏凱倫藻短時間內不會對鮑魚鰓中GSH-Px酶活性造成不利影響。

3 討論

據報道, 在毒性物質脅迫下, 生物體內的抗氧化酶變化呈現“鐘型”趨勢[14], 即短時間內酶活性經歷先被激活后被抑制的變化趨勢。本研究發現, 各個米氏凱倫藻處理組中, 鮑魚鰓內SOD酶活性均表現為“先誘導后抑制”效應。SOD是催化超氧陰離子自由基發生歧化反應的一類金屬酶, 能夠將體內超氧陰離子(O2–)轉化為過氧化氫(H2O2), 是機體防御過氧化損傷的關鍵酶。前24 h內, SOD酶活性急劇增高, 說明實驗體系中有大量活性氧產生, 機體為減輕活性氧造成的氧化損傷, 誘導SOD酶活力上升, 機體內O2–在SOD的催化下轉化為H2O2。24 h后SOD酶活性急劇下降, 最終顯著低于正常水平, 可能是機體內活性氧自由基大量增加, 超過了機體的清除能力, 組織受到活性氧的攻擊而受損, 影響了細胞合成SOD的能力, 導致其活力下降。

為清除機體內產生的大量H2O2, 機體需激活CAT、GSH-Px合成途徑。CAT可以清除SOD歧化超氧陰離子自由基產生的H2O2, 米氏凱倫藻處理組中, CAT酶活性均表現為持續下降的趨勢, 可能也是由于機體內活性氧自由基及過氧化氫均大量累積超過一定限度, 導致組織因受氧化損傷而影響了CAT酶的合成。GSH-Px也是一種過氧化物酶, 能夠催化H2O2氧化其他底物后生成H2O和O2, 米氏凱倫藻處理組中GSH-Px處于被誘導狀態, 可能由于生物體內CAT含量降低時, GSH-Px能代替CAT清除H2O2。目前, 已有研究表明, 部分甲藻或甲藻毒素可以造成生物體抗氧化系統的損傷, 抑制抗氧化酶的活性。例如, 鏈狀裸甲藻可以顯著抑制扇貝鰓內SOD、CAT酶活性[8], GTX2/3毒素可以導致小鼠肝臟內SOD酶活性下降[15], 塔瑪亞歷山大藻可導致扇貝消化腺、閉殼肌組織內SOD、CAT酶活性的下降[10]。由此可見, 本研究中未達到較高赤潮密度時, 米氏凱倫藻對鮑魚抗氧化酶的作用與其他甲藻對貝類的影響結果相似。

已有研究表明, 在水體環境因素(溫度、DO、pH、總氨氮)均適宜的條件下, 高密度米氏凱倫藻可以導致48 h內鮑魚死亡率急劇升高(>50%, 未發表), 然而, 米氏凱倫藻對鮑魚的脅迫方式仍不明確。研究發現, 米氏凱倫藻能夠產生溶血毒素、魚毒素、活性氧及部分細胞毒素[16-18], 這些毒性物質均為脂溶性物質, 極易通過細胞膜, 進入生物體內對其造成影響。其中, 米氏凱倫藻產生的超氧陰離子和過氧化氫, 能夠通過氧化細胞膜的膜脂, 對生物造成氧化損傷[3]。據報道, 許多甲藻對海洋生物的毒性作用與產生的活性氧有關。例如, 多環旋溝藻赤潮導致貝類死亡與藻細胞產生的活性氧有關[19], Tang 等[20]認為活性氧是引發其致死效應的主要原因。Yang等[21]認為赤潮異彎藻對虹鱒魚毒性效應也源于其產生的活性氧。活性氧對生物的影響主要是使酶變性、多聚糖解聚、DNA損傷導致遺傳改變[11], 還可能導致脂類分子過氧化, 從而使生物膜的完整性受到破壞。本研究中, 在較低赤潮密度下(不超過107個/mL), 米氏凱倫藻處理組中, 鮑魚雖保持較高存活率, 但其SOD、CAT酶活性均受到顯著抑制效應, 說明米氏凱倫藻有可能產生某些活性氧類物質, 導致短時間內鮑魚機體抗氧化系統遭受嚴重損傷, 從而造成對鮑魚生命活動的脅迫。

致謝: 本實驗得到了中國科學院海洋研究所馮頌博士、別煥章和陳燕的大力協助, 在此致以謝忱。

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(本文編輯: 梁德海)

Effects ofblooms on antioxidant enzymes in gastropod abalone,

LIN Jia-ning1, 2, YAN Tian1, ZHANG Qing-chun1, WANG Yun-feng1, LIU Qing1, ZHOU Ming-jiang1

(1. Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Shandong, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory of Riverine Ecological Conservation and Technology, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China)

To analyze the main threat ofon the physiological features of abalones, we investigated the effects ofon antioxidant enzymes of the abalone, including superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GSH-Px). The results showed that exposure to a low cell concentration of(not exceeding 104cell/mL) caused significantly adverse effects on the activity of SOD and CAT enzymes in the abalone gills, whereas no adverse effects were observed for the activity of GSH-Px. SOD activity showed an “induced and then inhibited” trend. Compared to the control group,increased SOD activities by 120%, 130%, and 130% during the first 24 h, respectively. Thereafter,caused significant declines in SOD activity of 77%, 77%, and 73% at 48 h. Moreover, compared to the control group, CAT activity was inhibited and declined continuously over 48 h, decreasing by 58%, 51%, and 37%. These results indicate that(not exceeding 104cell/mL) can cause inhibitory effects on the activities of antioxidant enzymes (SOD and CAT).We speculate that the occurrence of abloom could cause oxidative damage to abalone organs during short-term exposure.

Dec. 2, 2015

;; gill; antioxidant enzymes

X55

A

1000-3096(2016)06-0017-06

10.11759/hykx20150330001

2015-12-02;

2016-03-22

(41476102); 中國科學院戰略重點研究項目(XDA01020304)

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No.41476102; Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences, No. XDA01020304]

林佳寧(1988-), 女, 山東煙臺人, 博士, 主要研究方向為海洋生態學, E-mail: ljning0402@163.com; 顏天, 通信作者, 女, 研究員, 主要從事赤潮危害機制研究, E-mail: tianyan @qdio.ac.cn