紫菜納豆菌發酵物中醇提物和多糖生物活性的初步研究

黃鶯鶯, 董煥煥, 楊苗苗, 矯麗萍, 邵 霜, 岳 琪, 魏玉西

?

紫菜納豆菌發酵物中醇提物和多糖生物活性的初步研究

黃鶯鶯, 董煥煥, 楊苗苗, 矯麗萍, 邵 霜, 岳 琪, 魏玉西

(青島大學 生命科學學院, 山東 青島 266071)

納豆菌()發酵后的條斑紫菜經稀釋、離心后上清液用一定濃度的乙醇處理獲得醇沉物和醇溶液。將醇沉物去蛋白得到粗多糖, 進行抗氧化活性的研究; 將醇溶液旋轉蒸發得到浸膏, 將浸膏按極性大小分相萃取分別得到石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相浸膏, 探討分相浸膏對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、四聯微球菌的抑菌效果。通過測定多糖和分相浸膏對羥自由基(·OH)和DPPH自由基的清除能力評價其抗氧化能力。結果表明: 醇溶物對金黃色葡萄球菌具有抑制作用, 且隨著濃度的升高各相浸膏對羥基自由基的清除率隨之升高, 其中, 正丁醇相浸膏在質量濃度為0.5 mg/mL時對羥自由基的清除率達到91.6%, 說明條斑紫菜經納豆菌發酵可能產生了活性化合物; 與對照組相比, 利用納豆菌發酵紫菜發酵物中多糖提取率增加了0.24%, 發酵得到的多糖在質量濃度為5.0 mg/mL時對羥自由基的清除率達到了95.7%。

條斑紫菜(); 納豆菌(); 多糖; 醇提物; 抗氧化性; 抑菌活性

納豆菌, 別名納豆芽孢桿菌(), 是一種革蘭氏陽性菌。既具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力, 又能產生多種抗菌素和酶, 而且納豆菌分泌酶的能力比其他枯草芽孢桿菌高幾十倍[1-2]。納豆激酶是在納豆發酵過程中產生的一種絲氨酸蛋白酶, 具有溶解血栓、降低血黏度、改善血液循環、軟化和增加血管彈性等作用[3-4]。納豆菌發酵技術于2000多年前起源于我國, 目前在日本納豆作為一種傳統發酵食品, 一直是日本國民膳食結構的主要組成部分[5]。納豆菌發酵原料除大豆外, 還被用來與乳酸菌共同發酵制備酸奶, 以果渣為底物發酵剩余豆渣等[6], 發酵高檔水產品加工廢棄物和低值水產品, 并帶來較好的經濟效益[7-8]。

紫菜屬海洋紅藻, 其中含豐富的蛋白質、碳水化合物、各種維生素和礦物質。同時紫菜還可以入藥, 具有化痰軟堅、清熱利水、補腎養心之功效[9]。紫菜在我國各地人工養殖產量大, 資源相當豐富, 其應用前景廣闊。

國內已有學者研究以納豆菌發酵紫菜, 再添加木瓜蛋白酶酶解的方法從中提取紫菜蛋白多肽以及研究該法對蛋白提取率的影響[10]。但是, 關于納豆菌發酵物中多糖和醇溶物的生物活性均未見報道。本文利用納豆菌對條斑紫菜進行發酵, 以未發酵的條斑紫菜作對照, 研究條斑紫菜納豆菌發酵物中多糖和醇溶物的抗氧化和抑菌活性, 預期研究結果對充分利用紫菜資源提供重要基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

條斑紫菜(干), 2014年12月購自江蘇連云港和潤紫菜加工有限公司。

1.1.2 菌株

納豆芽孢桿菌()菌粉購自中山市納豆微生物制品有限公司; 枯草芽孢桿菌()、金黃色葡萄球菌()、四聯微球菌), 由青島大學生命科學學院微生物學實驗室提供。

1.2 主要儀器與設備

DXF-10A型多功能搖擺式粉碎機(廣州市大祥電子機械設備有限公司); YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業有限公司醫療設備廠); CR21G高速冷凍離心機 (上海安亭科學儀器有限公司); RE-52A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠); SW-OJ-IFD潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司); 721G可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司); 冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 醇提物和多糖的制備

參考文獻[11]并作適當改進。選取條斑紫菜(干)于40℃恒溫干燥箱中干燥12?h, 研磨成粉末后稱取兩份等量的紫菜粉末, 一份為實驗組, 另一份為對照組, 均按照料液比為1︰16加入蒸餾水, 攪拌均勻后放入高壓濕熱滅菌鍋中滅菌20?min。實驗組發酵條件為: 溫度43℃, 發酵時間24?h, 接種量為每3?g條斑紫菜樣品加0.01?g納豆菌。對照組除不加納豆菌外, 其余條件均與實驗組相同。發酵結束, 兩組同時按照料液比1︰40加蒸餾水, 常溫水提5?h, 冷凍離心(8?000?r/min)10?min。上清液加入95%乙醇并調至終濃度為80%, 于4℃的冰箱中靜置過夜后再次離心, 收集醇不溶物。上清液即為醇提物, 經旋轉蒸發后依次用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取12?h, 相同溶劑萃取兩次。合并萃取液經旋蒸得石油醚相浸膏(實驗組A, 對照組A)、乙酸乙酯相浸膏(實驗組B, 對照組B′)和正丁醇相浸膏(實驗組C, 對照組C′)。第一次醇沉得到的醇不溶物冷凍干燥后研磨, 按照水料比30︰1 (/)加水于80℃恒溫水浴鍋中放置1?h, 取出后冷卻至室溫, 離心(8?000?r/min) 20?min, 沉淀即為雜蛋白(棄去), 上清液加95%乙醇至體積分數為80%, 在4℃冰箱中靜置過夜, 離心(5?000?r/min) 10?min, 取沉淀物冷凍干燥即得粗多糖。

1.3.2 多糖含量的分析方法

總糖含量測定: 選用苯酚—硫酸法, 以葡萄糖為標準物, 在490?nm處測定多糖含量[12]。

紫菜多糖提取率(%)=紫菜多糖提取量/紫菜原料質量×100 %

1.3.3 蛋白質含量的分析方法

蛋白質的測定: 選用考馬斯亮藍比色法。

1.3.4 醇提物對三種菌的抑制作用

參考文獻[13-15]并作適當改進。旋轉蒸發后的各相浸膏均用二甲基亞砜作溶劑溶解, 分別取實驗組和對照組的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相浸膏樣品配制20?g/L的溶液, 對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、四聯微球菌進行抑菌實驗。用生理鹽水分別配制菌懸液。待培養皿濕熱滅菌冷卻后加入營養瓊脂培養基15 mL, 搖勻, 置水平位置待其凝固。將三種菌分別接入培養皿中, 用打孔器在培養基中等距離打7個孔, 向每個孔中加20?μL樣品溶液, 分別為對照組和實驗組不同相的6種溶液, 同時以二甲基亞砜作為空白對照。每種細菌設3個平行樣, 于37℃恒溫培養16~24 h后, 測量抑菌圈直徑, 找出抑菌效果最好的細菌作為后續實驗的指示菌。

分別取實驗組和對照組的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相浸膏樣品, 采用二倍稀釋法配制濃度為20, 10和5 g/L溶液。采用稀釋涂布平板法接種指示菌, 在每個培養皿上均勻地打7個孔, 每個孔中加樣20?μL, 以二甲基亞砜作為空白對照。于37℃恒溫培養16~24 h后, 測量、記錄結果。每個濃度梯度做3次平行實驗[16], 結果取平均值。

1.3.5 醇提物和多糖抗氧化活性的研究

1.3.5.1 對羥自由基的清除率

參考文獻[17]方法進行。多糖和旋轉蒸發后的各相浸膏均用去離子水溶解, 在Fenton體系下, 進行清除羥基自由基作用的研究。取標記好空白管、對照管以及不同濃度的樣品管, 先分別向試管中加入0.15?mol/L, pH7.4的磷酸鹽緩沖液0.5?mL, 6?mmol/L的EDTA二鈉亞鐵溶液0.5?mL, 520 μg/mL的番紅溶液0.1?mL, 再分別向不同濃度的樣品管中加入3.5?mL樣品的去離子水溶液, 最后再加入0.3%(/)的H2O20.4?mL。空白管將樣品溶液用等體積去離子水代替, 對照管將樣品溶液和H2O2溶液用等體積去離子水代替。混勻后放置于40℃恒溫水浴中保溫30?min, 然后在520?nm處測其吸光度。每個樣品重復操作3次, 取三次結果的平均值。實驗中將Vc作為陽性對照進行試驗。

清除率的計算公式: 清除率(%)=(樣品–空白)/ (對照–空白)×100%

式中:樣品為樣品管吸光度;空白為空白管吸光度;對照為對照管吸光度。

1.3.5.2 對DPPH自由基的清除率

參照文獻[18]方法進行。多糖和旋轉蒸發后的各相浸膏均用去離子水溶解, 分別向試管中加入不同濃度的樣品溶液2.0?mL, 然后分別加入0.2?mmol/L的DPPH溶液2.0?mL, 混勻后靜置30?min, 測定反應液在517?nm處的吸光度i; 以無水乙醇作參比, 測定2.0?mL DPPH溶液與2.0?mL無水乙醇混合后的吸光度0; 測定2.0?mL的樣品溶液與2.0?mL無水乙醇混合后的吸光度j。實驗以Vc作為對照。

清除率的計算公式: 清除率(%)=[1–(i–j)/0]×100%

式中:i-樣品管吸光度;j-空白管吸光度;0-背景吸收。

1.3.5.3 對超氧陰離子的清除率

參照文獻[19]方法進行。用去離子水將紫菜多糖溶解, 采用鄰苯三酚自氧化法測其對超氧陰離子清除率。取4.5?mL Tris-HCl緩沖溶液(50?mmol/L, pH8.2)于25?mL試管中, 加入4.2?mL重蒸水混勻, 再放入37℃水浴中保溫, 20?min后取出并立即加入在37℃預熱過的0.5?mL 3?mmol/L鄰苯三酚溶液(以10?mmol/L HCl配制), 空白管用0.5?mL 10?mmol/L HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液, 迅速搖勻, 倒入比色皿, 于325?nm波長處每隔30?s測定吸光度(a)及空白管吸光度(b)。實驗組先加入2?mL各質量濃度的紫菜多糖溶液, 再加入鄰苯三酚溶液, 重蒸水相應減少, 再根據鄰苯三酚自氧化測定的方法操作, 測各樣品吸光度(i)。以10?mmol/L HCl溶液配制空白管作為空白, 測定其本底吸光度(j), 每個樣品重復3次取平均值。以Vc做陽性對照。

清除率的計算公式: 清除率(%)=[(a–b)–(i–j)]/(a–b)×100

2 結果與分析

2.1 兩組提取物旋蒸后各相浸膏的質量

實驗組和對照組均稱取150?g紫菜粉末, 經浸提、醇沉、分相萃取、旋蒸后, 最終得到各相浸膏的質量如表1所示。實驗組最終得到的各相浸膏質量均高于對照組, 推測紫菜經納豆菌發酵后其乙醇可溶性物質組成及含量發生了變化。