瑞舒伐他汀對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用及其機制

楊蕾,劉海龍，張斌，湯建民

(鄭州大學第二附屬醫院，鄭州450000)

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瑞舒伐他汀對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用及其機制

楊蕾,劉海龍，張斌，湯建民

(鄭州大學第二附屬醫院，鄭州450000)

目的探討瑞舒伐他汀對急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用及其機制。方法 從60只SD雄性大鼠中隨機抽取10只作為對照組，只分離不結扎前降支，余下的50只分別結扎其前降支制作AMI模型。24 h后存活的41只隨機分為3組，分別為AMI組13只、Statin1組14只、Statin2組14只。術后第1天起，Statin1、2組分別給予瑞舒伐他汀1.5、3.0 mg/(kg·d)灌胃,對照組及AMI組分別以等量的生理鹽水灌胃。4周后TUNEL法染色檢測心肌細胞凋亡指數(AI)，免疫組化法檢測線粒體融合蛋白2(Mnf2)表達，免疫印跡法檢測磷酸化Akt(p-Akt)表達，并進行比較。結果與對照組相比，AMI組及Statin1、Statin2組心肌細胞AI升高，p-Akt表達下降，Mnf2表達增加(P均<0.05)；與AMI組相比，Statin1、Statin2組心肌細胞AI和Mnf2表達均顯著降低(P均<0.05)，而p-Akt表達增高(P<0.05)，且Statin2組較Statin1組變化更為顯著(P<0.05)。結論 瑞舒伐他汀可抑制大鼠AMI后的細胞凋亡，其作用可能與下調Mnf2的表達有關，且呈一定劑量依賴性。

急性心肌梗死;細胞凋亡;線粒體融合蛋白2; Ras-PI3K/Akt；瑞舒伐他汀;大鼠

急性心肌梗死(AMI)后壞死心肌介導的炎癥反應，在促進壞死心肌修復愈合的同時，也加速心肌的重構并通過細胞因子的級聯效應導致心肌細胞凋亡。線粒體融合蛋白2(Mfn2)是線粒體外膜上的一種跨膜蛋白，其可能通過激活線粒體凋亡途徑，或抑制Ras-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B (PKB)通路，誘導心肌細胞發生凋亡[1]。他汀類藥物除抑制甲羥戊酸合成，還可抑制類異戊二烯的生成，影響Ras-PI3K/Akt通路，發揮其調節細胞凋亡、改善血管內皮功能、抗血小板、調脂、抗動脈粥樣硬化等作用[2]。本實驗于2015年4～10月建立大鼠AMI模型，研究瑞舒伐他汀對AMI大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用，并探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料健康成年SPF級SD雄性大鼠60只，體質量250～300 g，購自山西醫科大學實驗動物中心。試劑及藥品：Mfn2兔多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；PV9000試劑盒、DAB試劑盒(北京中杉生物工程公司)；凋亡試劑盒(德國roche公司)；瑞舒伐他汀鈣片(10 mg/片)，AstraZeneca公司。儀器：日本尼康顯微照像系統；微波爐(格蘭仕)；溫箱(電熱恒溫水浴箱DHG-9031,上海)；電子天平(BS224S,德國)。

1.2動物分組及模型建立健康成年SPF級SD雄性大鼠60只，適應性喂養7 d。隨機抽取10只為對照組，前降支下穿線不結扎；其余50只制作AMI模型：用10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，氣管切開插管，呼吸機輔助呼吸，潮氣量15 mL/kg,呼吸頻率70～80次/min，呼吸比2∶1，開胸后分離胸膜、心包，擠出心臟，以醫用縫線穿圓形塑料套管前結扎大鼠左前降支阻斷血流，造成AMI模型。24 h后存活41只大鼠，按照隨機數字表法分為3組，AMI組13只、Statin1組14只、Statin2組14只，術后第1天起Statin1、2組分別給予瑞舒伐他汀1.5、3.0 mg/(kg·d)灌胃，對照組及AMI組均以等量生理鹽水灌胃，每3天稱重1次并調整給藥劑量,共給藥4周。實驗結束時各組存活量分別為對照組10只、AMI組9只、Statin1組11只、Statin2組13只。

1.3心肌細胞凋亡指數(AI)的測算用轉移酶介導脫氧尿苷三磷酸缺口末端標記法(TUNEL)對組織石蠟切片行凋亡染色。凋亡細胞出現棕黃色顆粒為陽性，每張標本取3張切片，每張切片在心梗區域隨機取5個高倍鏡視野，記錄陽性細胞數，計算AI，AI=凋亡細胞核數/總細胞核數×100%。

1.4心肌組織中Mfn2表達的檢測采用免疫組化法。處死大鼠后取心臟標本，制作石蠟切片，選取梗死心肌組織邊緣區域(對照組在左室前壁)切片。依照試劑盒步驟檢測Mfn2。陽性切片作陽性對照，PBS切片作陰性對照，細胞內出現棕黃色顆粒為陽性，每張標本取3張，分析Mfn2蛋白陽性染色指數(陽性細胞數/視野細胞總數×100%)。

1.5心肌組織中p-Akt表達的檢測采用免疫印跡法。提取組織總蛋白，測定蛋白濃度。 蛋白上樣量為50 μg，經電泳、轉膜、封閉后，加入一抗(抗α-actin、抗p-Akt、抗Akt)，4 ℃放置12 h以上，加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗，平穩搖動，室溫放置2 h后檢測。

2　結果

2.1各組AI、Mfn2比較見表1。

2.2各組心肌組織 p-Akt 的表達比較與對照組比較，AMI組及Statin1、Statin2組心肌組織中p-Akt蛋白表達均降低(P均<0. 01);與AMI組比較，Statin1組、Statin2組p-Akt表達增加(P均<0.05) ，以Statin2組為著(P<0.05) ，見圖1、表1。

圖1　各組p-Akt表達的免疫印跡圖

組別AIp-AktMfn2對照組084.50±5.080.0480±0.0030*AMI組0.6087±0.0613*9.52±0.09*0.8850±0.0155*Statin1組0.3915±0.0334*#17.85±1.18*#0.6248±0.0558*#Statin2組0.2626±0.0297*#@28.35±2.29*#@0.3875±0.0478*#@

注：與對照組比較,*P<0.05;與 AMI組比較，#P<0.05; 與Statin1組比較，@P<0.05。

3　討論

既往認為AMI時以心肌細胞壞死為主。近年來多項相關動物實驗證實，AMI后細胞凋亡才是心肌細胞死亡的主要方式[3]。Kajstura等[4]在AMI動物模型中發現，梗死后約6 h心肌細胞凋亡可達到高峰，7 d仍有大量的心肌細胞發生凋亡。Bardales等[5]用TUNEL法檢測85例AMI死亡患者尸解的心肌細胞，凋亡率超過90%。

AMI發生后，缺氧、缺血、再灌注等誘因激活各種凋亡因子，調控相關信號通路,誘導細胞凋亡[6]。細胞凋亡信號轉導為多途徑且相互影響，研究發現,Ras-PI3K/Akt 路徑是促使心肌細胞發生凋亡的主要通路[7]。本實驗結果顯示,AMI組較對照組細胞凋亡明顯增多，同時心肌組織中p-Akt表達較對照組也明顯降低。以上結果均表明AMI后大量心肌細胞凋亡，與Ras-PI3K/Akt通路激活密切相關。

原癌基因Ras不僅能調控PI3K/Akt 通路，誘導細胞凋亡，還可通過PI3K非依賴型途徑直接激活Akt[8]。研究表明，Mfn2在心肌、骨骼肌和腦組織中高表達，其可能參與心肌細胞凋亡的早期活化，加速線粒體分裂，促使線粒體體積減小[9]。Mfn2對Ras有直接負調控作用，能阻滯Ras-PI3K/Akt 通路，抑制Akt磷酸化，繼而使B淋巴細胞瘤-2基因表達減少，促凋亡基因Bax表達增加，通過線粒體相關途徑參與細胞凋亡[10]。本實驗結果顯示,大鼠AMI造模成功后，梗死及周圍心肌組織Mfn2表達明顯增高，p-Akt表達明顯降低，這表明梗死后損傷激活Mfn2的表達，弱化Akt 磷酸化從而促發心肌細胞凋亡。

大量的循證醫學證實，他汀類藥物在冠心病防治過程中占據著不可替代的地位。隨著臨床廣泛應用及研究的深入，人們發現他汀類藥物有重要的獨立于調脂外的多重作用[11]：他汀類藥物除抑制甲羥戊酸合成，阻斷Cho的生成過程，還可抑制類異戊二烯，可與一些單體G蛋白(如Ras，Rho等)偶聯，增加后者的親脂性，影響Ras-PI3K/Akt 及Rho/Rho激酶信號通路、RAAS系統和過氧化物酶增殖物激活受體的活性，發揮其抑制心肌細胞凋亡、改善血管內皮功能、調脂、抗動脈粥樣硬化等作用，降低心血管疾病的發病率和病死率[2]。本實驗結果顯示,瑞舒伐他汀可使Mfn2表達明顯下調，抑制Ras相關信號通路的活化，減少大鼠AMI后的細胞凋亡，其作用表現出一定的劑量依賴性。

綜上所述，筆者認為Ras介導的PI3K/Akt信號通路可能在AMI后心肌細胞凋亡發生發展過程中起重要作用，而瑞舒伐他汀通過下調Mfn2表達，上調p-Akt水平，最終減少AMI后心肌細胞凋亡，防止AMI范圍進一步擴大導致心肌細胞壞死，從而對心功能不全及心室重構有一定的治療作用。

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湯建民(E-mail：tjmgrx@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.009

R541.4

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1002-266X(2016)17-0028-03

2015-11-18)