骨髓細胞形態學聯合細胞化學染色檢測在神經母細胞瘤診斷中的應用

單瑩，高丹，劉勇，盧麗萍，秦曉松，鄭銳

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004)

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骨髓細胞形態學聯合細胞化學染色檢測在神經母細胞瘤診斷中的應用

單瑩，高丹，劉勇，盧麗萍，秦曉松，鄭銳

(中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004)

目的探討骨髓細胞形態學聯合細胞化學染色檢測在神經母細胞瘤(NB)診斷中的應用。方法 NB患兒33例(病例組)，F3抗體陽性。對照組選自同期住院的患兒20例，F3抗體陰性。對兩組進行常規的骨髓細胞形態學顯微鏡鏡檢和細胞化學染色[過氧化物酶(POX)﹑堿性磷酸酶(NAP)﹑糖原(PAS)染色)]，并對其診斷效能進行分析。結果兩組NAP、POX、PAS染色陽性率比較，P均<0.01。顯微鏡下發現紫紅色的條索狀纖維樣物質和瘤細胞呈菊花團排列是診斷和鑒別診斷NB方法之一。骨髓細胞形態學觀察聯合PAS染色診斷NB的靈敏度及特異度均高于單獨細胞形態學觀察及PAS染色(P均<0.01)。結論 在形態學中發現紫紅色的條索狀纖維樣物質和瘤細胞呈菊花團排列是診斷和鑒別診斷NB方法之一。骨髓細胞形態學聯合細胞化學染色(PAS)可提高NB的診斷率。

神經母細胞瘤；細胞形態；細胞化學染色；診斷

神經母細胞瘤(NB)是最常見的兒童惡性實體腫瘤之一，病死率高[1]，其發病率呈逐年升高趨勢[2]。NB在新生兒期即可發病，早期便發生轉移[3]，嚴重威脅兒童生命，其轉移部位為骨、淋巴結、骨髓、眼眶和皮膚等[4]，且與原發灶大小無關。發病隱匿，早期診斷比較困難。發生骨髓轉移時，轉移至骨髓內的瘤細胞在形態上與原幼淋巴細胞和粒細胞很難區別，骨髓細胞學檢查發現不同原發灶的骨髓轉移形態特點不同，共同特點是涂片及邊緣可見數量不等，散在的成團、成簇的細胞[5]，多數病例的瘤細胞酷似原幼淋巴細胞，當病灶很小時，往往造成誤診誤治。 本研究中，我們結合細胞形態學及細胞化學染色做對比觀察，為NB篩查診斷提供細胞形態學及細胞化學染色的診斷依據?，F報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料取2008年8月～2012年6月于本院住院的NB患兒33例(病例組)，F3抗體陽性?；純耗?0例、女13例，平均年齡2.18歲。對照組選自同期住院的患兒20例，F3抗體陰性?；純耗?例、女13例，平均年齡3.69歲。20例中神經節細胞瘤3例，腎母細胞瘤9例，脂肪瘤2例，橫紋肌肉瘤2例，骨肉瘤1例，畸胎瘤1例，肝母細胞瘤1例，腎癌1例。

1.2方法采用骨髓穿刺法獲取髂前或髂后骨髓細胞。兩組分別進行骨髓細胞形態學鏡檢及血細胞涂片，血細胞涂片用淋巴分層液分離細胞，用甩片機甩片(瘤細胞數>10%)，形態學染色為常規瑞氏染色法。①細胞形態學：按照骨髓細胞形態學檢查的質量控制[6]和具有豐富閱片經驗的檢驗人員顯微鏡檢，每次染色都有陽性質控涂片及陰性質控涂片作對照，并在油鏡下觀察原始細胞，根據胞質中顆粒數和顏色進行劃分。②過氧化物酶(POX)染色：使用戊二醛-丙酮固定，水沖，加反應液，室溫10 min，水洗后染色，再水洗，干燥后鏡檢。③堿性磷酸酶(NAP)染色：10%甲醛甲醇固定液30 s水洗，待干，涂片浸入基質孵育液，水洗待干后，鏡檢。④糖原(PAS)染色：新鮮干燥的涂片乙醇固定10 min，水洗待干，過碘酸液20 min水洗待干，雪夫液30 min染色，用亞硫酸液沖洗，再用水沖洗待干，復染水洗，待干，鏡檢。⑤單克隆抗體與NB細胞反應(APAAP)法。應用軍事醫學科學院提供的單克隆F3(Ⅰ抗)，熒光標記羊抗屬免疫球蛋白(Ⅱ抗)進行免疫熒光染色[7]。

1.3判定標準形態學：細胞形態計數200個細胞，換算成百分率，瘤細胞占陽性的百分比，典型成團細胞和細胞呈菊花團樣或砌墻樣排列或看見條索狀纖維絲樣物質均按陽性計數。細胞化學染色：①POX染色：見胞質中出現藍色或藍黑色顆粒為陽性。無顆粒為陰性，顆粒小，分布稀疏為弱陽性；②NAP染色[8]：顆粒略粗較密集為陽性，顆粒粗大且布滿于整個胞質中為強陽性，無顆粒為陰性，稍有顆粒為弱陽性；③PAS染色(常規的過碘酸-雪夫反應法)：在油鏡下觀察200個原始細胞，根據胞質中顆粒數和顏色劃分，無顆粒為陰性，彌散性淺粉色為弱陽性，顆粒染色較深呈紫紅色為陽性，紅色粗大顆?；蜃霞t色塊狀為強陽性。

2　結果

2.1兩組細胞形態學和細胞化學染色結果詳見表1。

表1　兩組細胞形態學和細胞化學染色結果[例(%)]

注：與對照組同檢驗方法比較，*P﹤0.01。

2.2兩組細胞形態學和PAS染色診斷效能結果比較33例NB患兒中29例(87.8%)可見到細胞成團排列，或呈菊花團或砌墻排列，大部分可見紫紅色條索狀纖維樣物質，是NB細胞特有的特征之一。對照組中的瘤細胞，細胞形態觀察多數是單一的，散在的瘤細胞，個別有2～3個聚在一起的現象，無細胞成團排列，或呈菊花團或砌墻排列，未見紫紅色條索狀纖維樣物質。兩組細胞形態和PAS染色診斷效能結果比較詳見表2。

表2　兩組細胞形態和PAS染色診斷效能結果比較

3　討論

單克隆F3抗體檢測因其靈敏度、特異度都高，是最有效、最準確的檢驗方法，主要用于篩查NB。細胞形態學聯合細胞化學PAS檢查與F3抗體檢測進行效能比較，細胞形態和細胞化學染色聯合方法檢測中，其靈敏度為87.9%，特異度為95%,一致率為90.6%，大大提高對NB的診斷率。PAS染色可作為NB一種重要的輔助鑒別診斷方法。

小兒NB的檢測方法很多，免疫抗體檢測、超聲影像、骨髓鏡檢等,但是關于細胞化學染色，國外文獻報道很少，國內更為少見，本文嘗試用幾種化學染色方法對NB進行檢測，并比較其靈敏度和特異度，結果為POX>PAS>NAP。

POX染色主要反映細胞內過氧化物酶活性，血細胞所含的過氧化物酶主要是髓過氧化物酶，是粒細胞含量最多的一種蛋白質，本文中53例瘤細胞經POX染色結果均為陰性，表明所有瘤細胞中不含有此酶，在細胞化學染色中選用此方法，主要用于排除NB，也可鑒別粒細胞與NB細胞。操作中需要具有豐富閱片經驗的檢驗技術人員細心計數，因試劑標準化，其成本低，有利于普及。PAS主要反映細胞內糖原、粘多糖、黏蛋白的含量。根據胞質中糖原種類及含量多少，呈現粗細不等紅色顆粒、塊狀物質或均勻紅色。NB細胞中33例陰性，僅有1例弱陽性，胞質內顆粒呈彌散性淺粉色，該物質不是顆粒，可能與機體感染或發熱或藥物有關，原粒細胞胞質顆粒染色較深，呈紫紅色。原幼淋巴細胞呈紅色粗大顆粒或紫紅色塊狀。

NAP染色可反映粒細胞內NAP活性。部分腫瘤患兒NAP增高可能與機體炎癥反應有關，如發熱、藥物反應等。本文中，NAP染色診斷NB的靈敏度和特異度分別為48.5%和15.0%，說明NB的篩查用此方法不特異。

細胞形態學觀察是不可替代的重要檢查方法。NB瘤細胞具有成團聚集或呈菊花式排列特點，而一般瘤細胞無此特點。本研究結果顯示，細胞形態學聯合PAS檢查靈敏度及特異度均高于單獨細胞形態學及PAS染色。提示細胞形態學結合PAS可提高NB的診斷率，細胞形態學方法簡單，便于基層醫院應用。

NB有早期轉移的特點，當診斷為NB時應把骨髓涂片細胞學作為常規檢查[8]。早期轉移骨髓象表現為骨髓增生活躍，粒、紅、巨三系大致正常，少量NB細胞混雜于正常細胞之間，骨髓涂片染色鏡檢尋找瘤細胞[9]顯得十分必要。嚴重骨轉移時，NB細胞占優勢，易誤認為白血病。細胞形態學上瘤細胞具有成團聚集，或呈“菊花團”狀聚集，且瘤細胞間有嗜酸性粉紅色纖維絲狀物[10]，而原淋巴細胞和粒細胞無此特點；同時在NB伴有粒系、紅、巨三系不受抑制的特點，而白血病無論是急性淋細胞白血病還是急性粒細胞白血病，骨髓細胞多為單一一種細胞，并且有粒、紅、巨三系受抑現象；神經母細胞團周圍和散在神經母細胞之間可見紫紅色粗細不等的條索樣纖維物質，而急性淋巴細胞白血病、急性粒細胞白血病骨髓細胞形態中無此現象。這一重要的形態特點，可作為NB與急性淋巴細胞白血病、急性粒細胞白血癥鑒別的重要依據。當疑似NB時，應把骨髓涂片細胞學作為常規檢查，PAS可提高NB的診斷率，其可作為NB診斷和鑒別診斷重要的輔助方法。

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[3] Tang SQ. A review on treatment of high-risk neuroblastoma[J]. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za zhi, 2014,16(2):103-107.

[4] 張錦華.小兒隱匿型成神經細胞瘤診斷的探討[J].中華兒科雜志,1989,27(3):141-143.

[5] 李莉,叢玉隆,蔡力力,等.非造血組織腫瘤骨髓轉移的診斷及腫瘤細胞形態學特點[J].南方醫科大學學報,2014,34(10):1541-1545.

[6] 鄧天順.骨髓細胞形態學診斷檢查的質量控制探討[J].中國社區醫師醫學專業,2012,21(14):244.

[7] 白炎.兩個抗Leu-1樣抗體的產生和鑒定[J].軍事醫學科學院院刊，1983，28(6):603.

[8] 陳躍瓊.38例小兒神經母細胞瘤骨髓象分析[J].檢驗醫學與臨床，2010，7(17)：1887-1888.

[9] 尹樹國，張錦華.神經母細胞瘤的眼部改變[J].實用眼科雜志，1987,8(5)：479-481.

[10] 馬利禎.神經母細胞瘤的血液學分析[J].醫藥衛生，2015，44(4)：102-103.

鄭銳(E-mail:shanlinyu33@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.029

R730.4

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1002-266X(2016)17-0077-03

2015-09-08)