姜黃素對脂多糖誘導大鼠心肌細胞肥大的保護作用及機制

陸袁洲，殷樂，范標，王為群，邱祖紅，曹新宇，王緯經，衣昕

(1南通市通州區人民醫院，江蘇南通226399；2南通大學醫學院人體解剖學系)

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·基礎研究·

姜黃素對脂多糖誘導大鼠心肌細胞肥大的保護作用及機制

陸袁洲1，殷樂1，范標1，王為群1，邱祖紅1，曹新宇1，王緯經1，衣昕2

(1南通市通州區人民醫院，江蘇南通226399；2南通大學醫學院人體解剖學系)

目的研究姜黃素對脂多糖誘導大鼠心肌細胞肥大的保護作用，并探討其可能機制。方法 取新生1～2 d的SD大鼠乳鼠體外按差速貼壁分離法純化培養心肌細胞，設空白對照組、脂多糖組、脂多糖+姜黃素低劑量(12.5 mg/L)組、脂多糖+姜黃素中劑量(25 mg/L)組、脂多糖+姜黃素高劑量(50 mg/L)組。在相差倒置顯微鏡下觀察其形態學變化，并利用圖象分析系統測算細胞體積；考馬斯亮藍法檢測細胞的總蛋白含量；ELISA法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)；采用Till陽離子測定系統觀察細胞內[Ca2+]i瞬間變化。結果與空白對照組相比，脂多糖組心肌細胞體積顯著增大，細胞總蛋白含量明顯增多，釋放的TNF-α水平顯著增高(P<0.01)，心肌細胞內[Ca2+]i瞬間峰值明顯增高。與脂多糖組相比，脂多糖+姜黃素低、中、高劑量組心肌細胞體積變小、總蛋白含量減少、TNF-α水平降低、細胞內[Ca2+]i瞬間峰值降低，且呈劑量依賴效應。結論 姜黃素對脂多糖誘導的大鼠乳鼠心肌細胞肥大有保護作用，其機制可能與抑制細胞TNF-α產生及Ca2+超載有關。

心肌細胞肥大；姜黃素；脂多糖；腫瘤壞死因子α；Ca2+;大鼠

心肌肥大是多種心血管疾病的獨立危險因素，也是這些疾病的常見并發癥，主要在長期壓力負荷過重的情況下發生，初期的心肌肥大有一定的代償意義，后期失代償則嚴重影響心肌功能，嚴重可致心力衰竭。因此，防治和逆轉心肌肥大一直是心血管研究領域的重點課題之一[1]。姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的活性成分，具有清除氧自由基、減輕缺血缺氧造成的心肌損傷、抑制梗死后心室重塑、改善心功能[2]等功能。2014年4月～2015年12月，本研究探討了其對脂多糖(LPS)誘發大鼠心肌細胞肥大的保護作用及其機制。現報告如下。

1　材料與方法

1.1材料實驗動物:新出生1～2 d SD大鼠的乳鼠，雌雄不拘，由南通大學實驗動物中心提供。試劑及儀器：LPS(Sigma公司)；姜黃素(陜西森弗生物技術有限公司);DMEM培養基(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；考馬斯亮藍試劑盒(江蘇碧云天)；Fura-2/AM熒光探針(東仁化學科技有限公司)；超凈工作臺(江蘇吳縣市凈化技術研究所);CO2培養箱(Sheldon Manufacturing Inc)；倒置顯微鏡(奧林巴斯,日本)；79-1磁力加熱攪拌器(江蘇金壇中大儀器廠)；TDL-4型離心機(上海安亭科學儀器廠制造)；倒置相差顯微鏡(佳能,日本)；DNM-9602G酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)；Till陽離子測定系統(德國)；CIAS-1000型細胞圖象像分析系統(中國大恒集團有限公司)。

1.2SD大鼠乳鼠心肌細胞原代培養用75%乙醇消毒，無菌條件下取出心臟，用D-Hanks液洗凈，然后除去心臟相連的大血管及心房組織，再用眼科剪剪成小的組織塊，用0.08%的胰蛋白酶反復吹打，37 ℃恒溫消化10 min，棄上清液，再用0.08%的胰蛋白酶消化3～4次，收集消化完畢的細胞，置于含有DMEM的培養瓶中，放入37 ℃、5% CO2培養箱中，培養1.5 h。隨后將未貼壁的心肌細胞懸液用吸管吸出，以4×108/L接種于培養瓶中，置入37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.3細胞分組及培養上述細胞培養48 h后，接種于置有蓋玻片的24孔培養板中，設空白對照組、LPS組、LPS+姜黃素低劑量組、LPS+姜黃素中劑量組、LPS+姜黃素高劑量組，每組各24孔。空白對照組不做特殊處理；LPS組，培養液中加入LPS 1 mg/L；LPS+姜黃素低劑量組，姜黃素 12.5 mg/L孵育30 min后，再加入LPS 1 mg/L；LPS+姜黃素中劑量組，姜黃素 25 mg/L孵育30 min后，再加入LPS 1 mg/L；LPS+姜黃素高劑量組，姜黃素 50 mg/L孵育30 min后，再加入LPS 1 mg/L；上述各組繼續培養24 h。

1.4形態學觀察及細胞體積測定上述細胞培養24 h后，每組各取6孔，相差倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態變化并攝片。每孔隨機選擇4個視野，每個視野計算機細胞圖像分析系統測量20個細胞的直徑，計算細胞體積。

1.5心肌細胞總蛋白質測定上述細胞培養24 h后，每組各取6孔，按考馬斯亮藍試劑盒說明書操作步驟測定各組心肌細胞總蛋白質含量。

1.6心肌細胞TNF-α蛋白的測定上述細胞培養24 h后，每組各取6孔，收集細胞上清液，按照大鼠TNF-α ELISA 檢測試劑盒說明書步驟，測定各組細胞上清液中TNF-α水平。

1.7心肌細胞內[Ca2+]i瞬間變化測定取上述每組各6孔細胞，置于含有Fura-2/AM 3 μmol/L 的DMEM培養基中(含有0.2%的白蛋白)，37 ℃水浴中溫孵0.5 h，HEPES緩沖液沖洗后，用HEPES緩沖液在恒溫37 ℃條件下緩慢灌流(1 mL/min)，藥物均在指定時間加入灌流液中。每次選取8個搏動心肌細胞，測定細胞[Ca2+]i的瞬間變化。測定儀器為Till陽離子測定系統(德國)DM3000軟件，發射光波長為505 nm，激發光波長為340 nm及380 nm，采樣間隙為300 ms。

2　結果

2.1各組心肌細胞體積比較空白對照組、LPS組、LPS+姜黃素低劑量組、LPS+姜黃素中劑量組、LPS+姜黃素高劑量組細胞體積分別為(1 023.9±176.2)、(2 251.3±161.4)、(1 552.6±158.4)、(1 224.5±144.9)、(1 129.7±181.1)μm3。 與空白對照組比較，LPS組、LPS+姜黃素低劑量組、LPS+姜黃素中劑量組心肌細胞體積增大(P均<0.05)。而LPS+姜黃素低、中、高劑量組的心肌細胞體積隨姜黃素劑量的增高而逐漸減小(P均<0.05)，LPS+姜黃素高劑量組的心肌細胞體積已接近空白對照組。

2.2各組心肌細胞總蛋白、TNF-α水平及[Ca2+]i峰值比較見表1。

表1　各組心肌細胞總蛋白、TNF-α水平及[Ca2+]i峰值比較

注：與空白對照組比較，△P< 0.01；與LPS組比較，*P<0.01； 與LPS+姜黃素低劑量組比較，$P<0.01；與LPS+姜黃素中劑量組比較，#P<0.01。

3　討論

LPS即內毒素，是革蘭陰性菌細胞壁的一種成分，LPS可以激活體內免疫和炎癥反應系統，對機體造成廣泛的損害和影響，而心臟是最容易受累的器官[3～5]。大部分內毒素血癥患者會出現心功能不全的癥狀，進而導致心肌肥厚。諸多研究表明，LPS可以誘導心肌肥厚，心肌細胞總蛋白含量增多，心肌細胞體積增大[6～8]。內毒素所引起機體損傷的致病機理是通過Toll樣受體4介導的多條信號傳導通路所致，而非LPS本身的效應[9,10]。本研究結果也顯示，LPS能夠誘導乳鼠心肌細胞肥大，引起心肌總蛋白量增高。

TNF-α具有多種生物效應，可通過多種生物學途徑誘導心肌細胞肥大：①與腎素-血管緊張素系統相互作用，引起活性氧中間產物增殖，從而誘導心肌細胞肥大[11,12]；②能增加肌動蛋白和肌球蛋白重鏈的合成，直接導致心肌細胞肥大；③此外，還可以與白細胞介素(IL-1、IL-6)等共同作用，引起心肌細胞肥大[13]。本研究結果顯示，LPS誘導乳鼠心肌細胞肥大的同時，促進了心肌細胞高表達TNF-α。

細胞內Ca2+在心肌肥厚和基因表達中發揮著中心作用。有研究表明，胞內Ca2+信號增加，可以激活眾多下游信號因子，促進相關基因表達，導致心肌細胞肥大[14]。本研究結果顯示，LPS可以誘發心肌細胞內[Ca2+]i瞬間峰值升高。這可能與LPS導致心肌細胞Na+-K+-ATP酶的活性降低有關，其活性降低可以造成細胞內Na+潴留，由于細胞內Na+增多，通過Na+-Ca2+交換，Ca2+大量流入細胞內；同時由于Ca2+-ATP酶活性下降，胞內Ca2+泵出減少，最終導致胞內Ca2+超載[15]。此外有研究表明，LPS誘導心肌細胞高表達的TNF-α也能促進細胞內Ca2+濃度升高[16]。

姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的活性成分，屬于多酚類，由兩個鄰甲基化的酚以及一個β-二酮組成，具有多種生物學效應，例如清除氧自由基、抗炎、減輕缺血缺氧造成的心肌損傷、抑制梗死后心室重塑、改善心功能等[2]。本研究結果顯示，與LPS相比，預加入12.5、25、50 mg/L的姜黃素均可抑制心肌細胞體積增大，抑制細胞總蛋白量增多，抑制TNF-α表達和細胞內[Ca2+]i瞬間峰值增高，且呈劑量依賴效應。

綜上所述，姜黃素對LPS誘導的大鼠乳鼠心肌細胞肥大有保護作用，可能與抑制細胞TNF-α產生及Ca2+超載有關。

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南通市衛生局青年科研基金項目(WQZ2014015)。

衣昕(E-mail:yixin@ntu.edu.cn)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.008

R542.2

A

1002-266X(2016)17-0026-03

2015-12-28)