八寶景天總黃酮的提取及對α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

孫陶利，許曉輝，盧新華

八寶景天總黃酮的提取及對α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

孫陶利，許曉輝，盧新華

目的 比較3種提取八寶景天總黃酮的方法，探討提取的八寶景天總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。方法 采用水提法、醇提法和超聲法提取八寶景天總黃酮，用鹽酸-鎂粉反應、薄層色譜進行定性鑒別；用紫外分光光度計測定八寶景天總黃酮含量；建立96微孔板高通量篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的模型，測定不同方法提取的八寶景天總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。結果 3種方法提取的八寶景天總黃酮鹽酸-鎂粉反應均顯紫紅色，3種樣品在槲皮素對照品色譜相應位置上均有顯示相同顏色的斑點，色譜斑點分離好，顯色清晰；水提法、醇提法和超聲法提取八寶景天總黃酮含量分別是（2.80±0.46）%、（5.62±0.56）%、（5.30±0.62）%，醇提法和超聲法提取總黃酮含量比水提法高（P＜0.05）；水提法、醇提法和超聲法提取的八寶景天總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別是（38.30±1.54）%、（69.27±6.67）%、（61.23±5.20）%，與水提法、超聲法相比，醇提法得到的總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制率最高（P＜0.05），與陽性藥阿卡波糖相當（P＞0.05）。結論 70%乙醇回流提取八寶景天總黃酮含量高，對α-葡萄糖苷酶抑制活性強。

八寶景天；總黃酮；α-葡萄糖苷酶；提取；抑制

［Abstract］Objective To compare three extract methods of total flavonoids from Sedum spectabile Boreau，and explore its α-glucosidase inhibitory activity.Methods The water，ethanol and ultrasonic extract methods were used to extract total flavonoids from Sedum spectabile Boreau，qualitative identification used hydrochloric acid-magnesium powder reaction and TLC，the content of total flavonoids was determined by ultraviolet spectrophotometer.The model of 96 microplate highthroughput screening for α-glucosidase inhibitor was established，which was used to determine the αglucosidase inhibitory activity of total flavonoids from Sedum spectabile Boreau.Results Three total flavonoids from Sedum spectabile Boreau were all showed purple in hydrochloric acid-magnesium powder reaction，and the corresponding location on TLC were the same color of the spots，the spots were separated well and the color was clear.Three contents of total flavonoids from Sedum spectabile Boreau，extracted by water，alcohol and ultrasonic were（2.80±0.46）%，（5.62±0.56）%and （5.30±0.62）%respectively.The contents of total flavonoids extracted by ethanol and ultrasonic were higher than those by water extract method（P＜0.05）.The α-glucosidase inhibitory rates of three kinds of total flavonoids were（38.30±1.54）%，（69.27±6.67）%and（61.23±5.20）%respectively.Compared with total flavonoids extracted by water and ultrasonic，total flavonoid extracted by alcohol showed the better α-glucosidase inhibitory activity（P＜0.05），which was comparable to the positive drug acarbose（P＞0.05）.Conclusion High content of total flavonoids from Sedum spectabile Boreau is extracted by 70%ethanol reflux，and shows potent α-glucosidase inhibitory activity.

［Key words］Sedum spectabile Boreau；Total flavonoids；Alpha-glucosidase inhibition；Extraction；Inhibition

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑 八寶景天（青州香艷花卉苗木園藝場），pH 6.8自配的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），阿卡波糖（每片50 mg，德國拜耳公司）；無水乙醇（分析純），槲皮素（上海哈靈生物科技有限公司），AB-8大孔吸附樹脂（西安藍曉科技有限公司），α-葡萄糖苷酶（美國Sigma公司），4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，pNPG，美國Sigma公司）。

1.1.2儀器 UV-9000紫外分光光度計（上海分析儀器廠），離心機（TGLW16，上海趙迪生物科技有限公司），酶標儀（Thermo MK3，上海賽默科技生物發展有限公司），旋轉蒸發儀（RE52CS型，上海亞榮生化儀器廠），干燥箱（101A-2，上海康路儀器設備有限公司），電子分析天平（AUY220型，日本島津儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1八寶景天總黃酮的提取

1.2.1.1水提法 稱取八寶景天莖葉200 g，加入3 000 mL去離子水，料液比1∶15，煎煮3次，每次2 h。合并水提液，減壓濃縮，95%乙醇沉降除去水溶性雜質，濾過，濾液濃縮至干，取少許于試管中，鹽酸-鎂粉反應鑒別為紫紅色，其余溶液減壓濃縮，干燥，得八寶景天總黃酮粗品。AB-8大孔吸附樹脂純化，得八寶景天總黃酮（樣A）。

1.2.1.2醇提法 稱取八寶景天莖葉200 g，加入3 000 mL 70%乙醇，料液比1∶15，回流提取3次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮，干燥，取少許于試管中，鹽酸-鎂粉反應鑒別為紫紅色，即為八寶景天總黃酮粗品。AB-8大孔吸附樹脂純化，得八寶景天總黃酮（樣B）。

1.2.1.3超聲法 稱取八寶景天莖葉200 g，加入3 000 mL 70%乙醇，料液比1∶15，常溫下超聲（80 Hz）提取3次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮，干燥，取少許于試管中，鹽酸-鎂粉反應鑒別為紫紅色，即為八寶景天總黃酮粗品。AB-8大孔吸附樹脂純化，得八寶景天總黃酮（樣C）。

1.2.2八寶景天總黃酮的定性鑒別

1.2.2.1理化鑒別 鹽酸-鎂粉反應，取少許樣A、樣B、樣C粉末，溶于1 mL甲醇中，加入少許鎂粉振搖，滴加幾滴濃鹽酸，1～2 min后觀察，顯紫紅色。

1.2.2.2薄層色譜鑒別 取樣A、樣B、樣C粉末約50 mg，加甲醇10 mL，超聲處理15 min，過濾，取續濾液作為供試品溶液；另取槲皮素標準對照品2 mg，加10 mL甲醇溶解，作為標準對照品溶液。分別吸取上述溶液10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，使成圓點狀，采用鹽酸飽和后的甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）為展開劑展開，取出，晾干，分別在日光及365 nm紫外光燈下檢視。

1.2.3標準曲線制備及方法學驗證

1.2.3.1對照品溶液的配制 精密稱取120℃干燥至恒重的槲皮素對照品1.8 mg置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得，4℃冰箱內保存備用。

1.2.3.2樣品溶液的配制 精密稱取樣A、樣B、樣C各50 mg置于50 mL容量瓶中，加入無水乙醇40 mL，超聲（80 Hz）10 min，取出，放至室溫，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取濾液即得。

1.2.3.3檢測波長的選擇 精密吸取對照品溶液和樣A、樣B、樣C溶液各5.0 mL于50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，混勻，在190～400 nm掃描，對照品和樣A、樣B、樣C溶液在370 nm均有最大吸收峰，檢測波長選擇370 nm。

1.2.3.4線性關系考察 精密吸取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，搖勻，于370 nm處測定其吸光度（absorbence，A），以A為縱坐標，質量濃度C （μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得方程為 A=0.065 1C+0.048 3（r=0.999 2），線性范圍為0.36～3.6 μg/mL。

1.2.3.5日內精密度實驗 精密吸取對照品溶液2.0 mL于50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，搖勻，測定其A370值，連續測定6次，以A370值計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.31%，日內精密度良好。

1.2.3.6日間精密度實驗 精密吸取對照品溶液2.0 mL于50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，搖勻，測定其A370值，連續測定5 d，以A370值計算RSD為0.38%，日間精密度良好。

1.2.3.7穩定性實驗 精密吸取樣A、樣B、樣C溶液各2.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，搖勻，放置0 min、10 min、20 min、40 min、1 h、2 h、3 h后測定其A370值。計算得RSD依次為0.32%、0.27%、0.12%。

1.2.3.8重復性實驗 精密稱取樣A、樣B、樣C 各50 mg，各5份，置于50 mL容量瓶中，加入無水乙醇40 mL，超聲（80 Hz）10 min，取出，放至室溫，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，分別取濾液2.0 mL于50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，搖勻，測定A370值，計算得 RSD依次為0.81%、0.73%、0.31%。

1.2.3.9加樣回收率實驗 精密稱取樣A、樣B、樣C溶液各1.0 mL于50 mL容量瓶中，各6份，每份加對照品溶液1.0 mL，加入無水乙醇40 mL溶解，定容，并測定A370值，計算得平均回收率依次為100.3%、97.5%、98.2%，RSD依次為1.98%、2.17%、2.11%。

1.2.4樣A、樣B、樣C含量測定 精密稱取樣A、樣B、樣C各50 mg于50 mL容量瓶中，加入無水乙醇40 mL，超聲（80 Hz）10 min，取出，放至室溫，加溶劑定容至刻度。搖勻，濾過，取續濾液，得1 mg/ mL樣A、樣B、樣C溶液。精密吸取2.0 mL樣A、樣B、樣C溶液于50 mL容量瓶中，定容，搖勻，測定A370值，每個樣品測3次，將A370值代入回歸方程A= 0.065 1C+0.048 3（r=0.999 2）計算樣A、樣B、樣C質量濃度及含量。

1.2.5α-葡萄糖苷酶抑制活性測定所需溶液的配制1.2.5.1 底物pNPG溶液配制 精密稱取11 mg pNPG，加入14.6 mL PBS（pH 6.8）溶解，配制成2.5 mmol/L pNPG溶液，分裝，-20℃凍存。

1.2.5.2α-葡萄糖苷酶溶液配制 精密稱取0.5 mg凍干酶粉，加入12.5 mL PBS（pH為6.8）溶解，配制成0.4 U/mL酶溶液，分裝，-20℃凍存。

1.2.5.31 mg/mL陽性藥（阿卡波糖）溶液配制 取1片阿卡波糖（每片含阿卡波糖50 mg），加入50 mL PBS（pH 6.8）溶解，離心，取上清，分裝，4℃保存。1.2.5.4 1 mg/mL樣品溶液配制 稱取樣A、樣B、樣C各10 mg，加入100 μL二甲基亞砜溶解，取10 μL八寶景天總黃酮二甲基亞砜溶液，加入990 μL PBS，得1 mg/mL樣品溶液。

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 實驗分為對照組、空白組、樣品組（樣A、樣B、樣C和阿卡波糖）、樣品空白組（樣A空白、樣B空白、樣C空白和阿卡波糖空白），各反應物按表1中劑量在96微孔板中進行加樣，每組3個平行孔。按表依次加入PBS、樣品溶液（樣A、樣B、樣C和阿卡波糖）和底物pNPG，混合均勻，于37℃水浴保溫10 min，結束后，取出，加入37℃水浴的酶溶液，充分混勻，于37℃水浴反應30 min。立即在405 nm處測定其A405值，根據公式:抑制率（%）=1-｛［（A對照-A空白）-（A樣品-A樣品空白）］/（A對照-A空白）｝×100%計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

表1　試劑、樣品加入劑量和順序

1.3統計學處理 應用SPSS 13.0軟件，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1八寶景天總黃酮薄層色譜鑒別 3種樣品在槲皮素標準對照品色譜相應位置上均有顯示相同顏色的斑點，色譜斑點分離好，顯色清晰（圖1）。

圖1　薄層色譜鑒別

2.2α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 各反應物按表1中劑量在96微孔板中進行加樣，每組3個平行孔，計算各組A405值（表2）。

表2　α-葡萄糖苷酶抑制活性各組A405值（±s）

表2　α-葡萄糖苷酶抑制活性各組A405值（±s）

組 別　A405值空白組　0.039±0.002對照組　1.295±0.176 樣A組　0.844±0.007 樣A空白組　0.069±0.011 樣B組　0.464±0.013 樣B空白組　0.078±0.007 樣C組　0.568±0.007 樣C空白組　0.081±0.003阿卡波糖組　0.386±0.013阿卡波糖空白組　0.044±0.005

2.3樣A、樣B、樣C含量測定結果和α-葡萄糖苷酶抑制率 3種方法提取得到的八寶景天總黃酮含量依次為（2.80±0.46）%、（5.62±0.56）%、（5.30± 0.62）%（表3），與水提法相比，醇提法和超聲法提取得到的總黃酮含量較高（P＜0.05）。取各組A405值的平均值（表2）代入公式計算1 mg/mL樣A、樣B、樣C和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率依次為（38.30±1.54）%、（69.27±6.67）%、（61.23± 5.20）%、（72.77±5.43）%（表3）。樣B對α-葡萄糖苷酶抑制率與阿卡波糖比較差異無統計學意義（t= -0.705，P＞0.05），樣A、樣C對α-葡萄糖苷酶抑制率不及阿卡波糖（t分別為10.59、-2.66，P＜0.05，表3）。

表3　樣A、樣B、樣C含量測定及α-葡萄糖苷酶抑制率（%）

3 討論

八寶景天俗稱八寶、蝎子草、華麗景天、長藥景天，為景天科景天屬多年生肉質草本植物，以全草入藥，終年可采，多鮮用［11-12］，具有祛風利濕、活血散瘀、止血止痛的作用。外用治療跌打損傷、疔瘡腫毒、燙火傷、蜂螯、雞眼、蛇蟲咬傷、手足癬和皰疹，內用治療吐血、咽喉炎、乳腺炎、蕁麻疹［11］。黃酮類物質是八寶景天提取物的主要活性成分之一。作者選取3種較為經典的提取黃酮的方法提取八寶景天總黃酮，建立了96微孔板高通量篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的模型，首次測定了八寶景天總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制活性；結果顯示醇提法和超聲法提取得到的八寶景天總黃酮含量較水提法含量高，可能是醇提法和超聲法所采用的溶劑相同，均是70%的乙醇，所以這2種方法得到的八寶景天總黃酮含量相當。而八寶景天總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制活性結果顯示，醇提法得到的八寶景天總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制活性最強，與相同含量阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性相當，超聲法次之，水提法對酶的抑制活性最差。結合醇提法和超聲法得到的八寶景天總黃酮含量測定結果和對α-葡萄糖苷酶抑制活性結果，進一步說明總黃酮含量相同的情況下，對α-葡萄糖苷酶抑制活性不一定相同，可能與提取方法不同，從而得到的總黃酮成分不同有關。

α-葡萄糖苷酶又稱α-葡萄糖苷水解酶、麥芽糖酶，它能夠從低聚糖類底物的非還原端切開α-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，在機體的多種代謝過程中起著關鍵的作用，它與許多因代謝紊亂失調而引起的疾病如糖尿病等密切相關［13-14］。在體外適宜條件下，α-葡萄糖苷酶可與pNPG（底物）發生酶解反應，底物pNPG水解后釋放出的配基硝基酚顯黃色，可在405 nm處測定其A405，從而根據其A405可判斷α-葡萄糖苷酶的活性。因而尋找合適的α-葡萄糖苷酶抑制劑將是糖尿病患者控制血糖的一種有效手段。多種藥用植物中的黃酮類物質能有效地抑制α-葡萄糖苷酶活性，發揮降血糖的作用［6-8］。本研究醇提法提取的八寶景天總黃酮含量和α-葡萄糖苷酶抑制活性均較高。在今后的研究工作中，作者將進一步對八寶景天總黃酮提取工藝進行優化，以篩選出總黃酮含量高、酶抑制活性強的提取工藝。本研究首次發現，八寶景天總黃酮能顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性，提示八寶景天總黃酮可能是治療糖尿病的天然藥物，對八寶景天降血糖作用及機制研究有一定的參考價值。

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Extraction of total flavonoids from Sedum spectabile Boreau and its α-glucosidase inhibitory activity

SUN Taoli1，2，XU Xiaohui3，LU Xinhua1
（1.Xiangnan University，Chenzhou Hunan 423000，China；2.Changsha Medical University，Changsha Hunan 410219，China；3.Lanzhou Institute for Food and Drug Inspection，Lanzhou Gansu 730000，China）

R282.71

A

2095-3097（2016）04-0202-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2016.04.003

湘南學院科學研究項目（2014XJ61）

423000湖南郴州，湘南學院（孫陶利，盧新華）；410219湖南長沙，長沙醫學院（孫陶利）；730000甘肅蘭州，蘭州市食品藥品檢驗所（許曉輝）

α-葡萄糖苷酶是水解碳水化合物的關鍵酶，抑制α-葡萄糖苷酶能延緩碳水化合物的水解，延遲葡萄糖入血，有效地抑制糖尿病患者餐后血糖的升高［1-2］。因此，多種 α-葡萄糖苷酶抑制劑（阿卡波糖）已成功應用于臨床治療糖尿病。這些已經運用于臨床的α-葡萄糖苷酶抑制劑大部分屬于人工生物或化學合成藥物，具有一定的不良反應［3-5］。近年來，通過從藥用植物中尋求天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑，從而獲得高效低毒的藥物已經成為治療糖尿病研究的熱點。研究發現，多種藥用植物中的黃酮類物質能有效地抑制α-葡萄糖苷酶活性，發揮降血糖的作用［6-8］。八寶景天是景天科景天屬多年生肉質草本植物［9-10］，最早在《神農本草經》中有其作為民間藥材的記載［10］。《辭海》中提到“全草入藥，用以治風濕病、糖尿病”。國內外對其研究主要集中在其生物學特性和景觀效應上，對其藥用活性研究很少［11］。八寶景天提取物中含有豐富的黃酮類物質，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用鮮見報道［11-12］。本實驗旨在采用3種不同的方法提取八寶景天總黃酮，建立96微孔板高通量篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的模型，測定八寶景天總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制活性。

（2016-01-19 本文編輯:徐海琴）