抗CD71單抗與蓖麻毒蛋白A鏈免疫毒素的制備及其體外抗肝癌細胞效應的研究

申蘇建，鄭波，蔡振寨，徐昌隆，薛戰雄

·論著·

抗CD71單抗與蓖麻毒蛋白A鏈免疫毒素的制備及其體外抗肝癌細胞效應的研究

申蘇建，鄭波，蔡振寨，徐昌隆，薛戰雄

目的因抗CD71單抗具有靶向定位特性，及利用蓖麻毒蛋白A鏈（RTA）的細胞毒性，將兩者進行偶聯，構建免疫毒素CD71 Mab-RTA，并研究其體外抗肝癌細胞效應。方法從蓖麻籽中提純RTA，以N-琥珀酰胺-3（-2-吡啶二硫）丙酸酯［N-succinimidyl-3（-2-pyridyldithio）-propionate，SPDP］作為偶聯劑，偶聯抗CD71單抗，構建免疫毒素（IT），以SDS-PAGE檢測IT，以間接ELISA方法測定IT的免疫反應性，以WST-1法測定IT的體外抗肝癌細胞效應。結果蓖麻籽經過研磨、過濾、親和層析、凝膠層析、離子交換層析等步驟成功提純RTA。提純的RTA與CD71mab進行偶聯，成功構建免疫毒素CD71 Mab-RTA，SDS-PAGE結果顯示，在非還原狀態下，為一條分子量＞116 kD的單一電泳條帶，在還原狀態下，為三條電泳條帶，分別位于約55 kD處、約32 kD處及約28 kD處。間接ELISA結果顯示，免疫毒素與單抗的曲線走勢一致，但各濃度下OD值均較單抗組略低。WST-1結果顯示，IT在各濃度梯度下均表現出對HepG2細胞和LO2細胞不同的殺傷作用（＜0.05）。結論CD71 mab-RTA基本保留了免疫反應性，及表現出對HepG2細胞和LO2細胞的不同體外細胞毒效應，提示對肝癌細胞具有較好的靶向細胞毒作用，有望成為新型的抗肝癌藥物。

肝腫瘤；癌；免疫毒素；蓖麻毒蛋白；CD71

[Modern FracicalMedicine， 2016，28（7）：847-850]

1　資料與方法

1.1儀器、試劑與細胞株蓖麻籽（浙江可得豐種業有限公司）；UV-2800型紫外可見分光光度計（尤尼柯儀器有限公司）；SPDP（sigma公司）；sepharose 4B、sephadex G-100、DEAE-Sephadex A-50、CM-sephadex C-50、sephadex G-25、sephadex G-150、Blue-sepharose CL-6B（Amershan Bioscience公司）；D-半乳糖、DTT、-巰基乙醇（西安沃爾森生物技術有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；HRP標記的羊抗小鼠IgG，DAB顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；HepG2細胞株、LO2細胞株（廣州市齊云生物技術有限公司）；CD71 mab （ancell公司）；WST-1試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2方法

1.2.1蓖麻毒蛋白的提取將80g去殼研碎的蓖麻籽在0.01mol/L，pH7.2的磷酸緩沖液中浸提24h后進行過濾。將所得濾液以硫酸銨（80%）進行鹽析，離心，棄上清，留沉淀。將沉淀溶于同樣濃度、pH值的磷酸緩沖液中透析24h，離心，上清液即為蓖麻毒蛋白粗提液。將上述粗提液上酸化后的 sepharose 4B柱，用含0～0.2 mol/L D-半乳糖的磷酸緩沖液進行梯度洗脫，得到凝集素和蓖麻毒蛋白的混合液。再將此混合液上SephadexG-100柱以上述磷酸緩沖液洗脫，得到蓖麻毒蛋白。

1.2.2蓖麻毒蛋白A的提純將上述提純的蓖麻毒蛋白上sepharose4B柱，以含 -巰基乙醇的Tris-HCl緩沖液進行洗脫，獲得RTA粗品。將獲得的RTA粗品以0.1 mol/L，pH8.5的Tris-HCl緩沖液透析過夜，上DEAE-Sephadex A-50柱進行洗脫，將得到洗脫蛋白峰液經過超濾濃縮后以0.005mol/L，pH6.5的磷酸緩沖液透析過夜，然后上CM-sephadexC-50柱，以0～0.4 mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，即可獲得RTA純品。

1.2.3免疫毒素的制備及檢測

1.2.3.1免疫毒素的制備將CD71 mab與溶于乙醇的SPDP（20 mol/L）進行混合反應30 min后，上sephadexG-25柱進行洗脫，除去游離的SPDP，得到單抗-PDP。在單抗-PDP溶液中加入還原劑二硫蘇糖醇（DTT），反應20 min后再上sephadex G-25柱，除去游離的DTT，得到單抗-PDP-SH。在提純的RTA中加入DTT，上sephadex G-25柱，洗脫除去多余的DTT，得到RTA-SH。將單抗-PDP-SH和過量RTASH混合反應16 h，離心，取上清，過sephadex G-150柱進行洗脫，提取IT粗品。將獲得IT粗品上Bluesepharose CL-6B柱進行洗脫，提純IT。

1.2.3.2以SDS-PAGE檢測IT的偶聯以分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，分別將IT進行還原性（樣品緩沖液加 -巰基乙醇）和非還原性（樣品緩沖液未加 -巰基乙醇）兩種處理。

1.2.3.3以間接ELISA方法測定免疫反應性肝癌HepG2細胞經培養、固定及封閉后，以PBST洗滌后，每孔（每個濃度設5個復孔）加入100μl倍比稀釋的單抗CD71 mab和免疫毒素，孵育、洗滌后，每孔加入100μl稀釋后的HRP標記的山羊抗小鼠IgG，再經孵育、洗滌，每孔加入OPD底物反應液100μl，室溫避光反應10min，硫酸終止反應，在酶標儀上測定490 nm吸光度值。

1.2.3.4以WST-1法分別測定免疫毒素和蓖麻毒蛋白對人肝癌細胞HepG2細胞和人正常肝細胞LO2細胞的毒性作用分別取HepG2細胞和LO2細胞，以每孔5×103的細胞密度接種到96孔細胞培養板，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養24 h，棄上清后分別加入各組相應培養液100μl：實驗組為加入含一系列濃度梯度的免疫毒素或蓖麻毒蛋白的培養液，濃度梯度均設為0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml 和0.5μg/ml，每個濃度設5個復孔；對照組為加入不含免疫毒素或蓖麻毒蛋白的等量培養液；空白組為不含細胞只加等量空白培養液，以空白組調零。之后再將96孔細胞培養板置37℃，5%CO2培養條件中培養48 h。按照試劑盒使用說明配置 WST-1溶液，每孔加入10μl WST-1溶液，在細胞培養箱孵育2 h后，將96孔板置于搖床上搖動1 min，在450 nm測定吸光度。按照以下公示計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率（%）=（1—給藥組OD值/對照組OD值）×100%。

1.3統計方法采用SPSS20.0統計軟件進行統計學分析。所有數據采用均數±標準差表示，采用檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1蓖麻毒蛋白和RTA的提純蓖麻毒蛋白粗提液經sepharose4B柱及sephadexG-100柱洗脫，因ricin和凝集素均具有與D-半乳糖結合能力及兩者之間分子量不同（蓖麻毒蛋白約為66 kD，凝集素約為120 kD），故蓖麻毒蛋白可成功提純。第一峰為凝集素，第二峰為蓖麻毒蛋白。見封二彩圖1。

-巰基乙醇可還原ricin，使其分解為 RTA和RTB，經DEAE-sephadex A-50柱及 CM-sephadex C-50柱洗脫，因蓖麻毒蛋白、RTA及RTB與該柱的結合能力不同，故可提純RTA，第二峰為RTA，見封二彩圖2。

將經sephadexG-150柱獲得的IT粗品，經Bluesepharose CL-6B柱，因其可吸附含RTA的偶聯物，故可將免疫毒素和單抗-PDP分離，實現IT提純，見封二彩圖3。在樣品緩沖液中未含有 -巰基乙醇時，免疫毒素表現為一條分子量大于116 kD的單一電泳條帶（封二彩圖4）。而在樣品緩沖液中含有 -巰基乙醇時，免疫毒素結構中的二硫鍵斷裂，表現為三條電泳條帶，即約55 kD處的單抗重鏈、約28 kD處的單抗輕鏈及約32 kD處的RTA（封二彩圖5）。

2.2間接ELISA方法測定IT的免疫反應性結果顯示，免疫毒素組曲線與抗CD71單抗組曲線基本趨勢一致，但各濃度吸光度比之抗CD71單抗組略有下降，見封二彩圖6。 2.3WST-1法測定IT和蓖麻毒蛋白對HepG2細胞和LO2細胞增殖的抑制作用結果顯示，在不同濃度下，蓖麻毒蛋白對兩類細胞均具有明顯的生長抑制作用；免疫毒素則表現出不同的生長抑制作用，對HepG2細胞的生長抑制明顯強于LO2細胞（P＜0.05），見封三彩圖7和封三彩圖8，及表1～2。

表1　不同濃度蓖麻毒蛋白對HepG2細胞和LO2細胞的生長抑制作用

表2　不同濃度免疫毒素對HepG2細胞和LO2細胞的生長抑制作用

3　討論

原發性肝癌（HCC）惡性程度高，傳統治療方式如手術、放化療等難以使患者受益。因此，尋找更為有效、副作用小的治療手段迫在眉睫［3-5］。

蓖麻毒蛋白是一種從蓖麻籽中分離得到的具有強烈毒性的天然毒素蛋白，其對所有哺乳動物真核細胞都有毒性作用，且對某些惡性腫瘤細胞的毒性更強，因此成為醫學上用于殺傷腫瘤細胞的首選毒素之一。蓖麻毒蛋白由A、B兩條鏈構成（RTA和RTB），RTA是活性鏈，即毒性鏈，相對分子質量約為31 kD，RTB是結合鏈，相對分子質量約為34 kD，其上含有半乳糖結合位點，故能與細胞上含半乳糖的糖蛋白或糖脂結合。RTA進入胞質后，可破壞核蛋白體60S亞單位，抑制蛋白質的合成，致使細胞死亡。由于RTB與細胞的結合是非特異的，因此限制了它在腫瘤治療方面的應用［6-7］。

如何使蓖麻毒蛋白只作用于肝癌細胞，而不損傷正常細胞，是其應用于醫學，尤其是肝癌治療的關鍵。

近年來，分子靶向治療的研究取得了較大進展，是現在腫瘤治療領域的突破性和革命性的發展，代表了腫瘤生物治療最新的發展方向，其利用腫瘤組織或細胞高度表達的具有特異性的結構分子作為靶點，選擇某些能與這些靶分子特異性結合的抗體或配體等達到導向治療目的一類療法［8］。

CD71，即轉鐵蛋白受體，是一種通過與轉鐵蛋白相互作用調節鐵吸收的跨膜糖蛋白，在細胞生長和增殖中發揮重要作用。在正常細胞中，轉鐵蛋白受體呈低水平表達，但在肝癌細胞中，由于其快速生長，故對鐵的需求量明顯增加，轉鐵蛋白受體的表達亦顯著增加，可作為肝癌生物靶向治療的特異性靶點［9-12］。

免疫毒素是一組人工構建的具有靶向細胞殺傷能力的雜合分子，其由毒性部分和靶向部分組成。毒性部分可以是植物、動物、微生物來源的細胞毒素，靶向部分可以是單克隆抗體或細胞因子［13-14］。本研究正是根據蓖麻毒蛋白 A鏈的高效生物毒性和CD71在肝癌細胞表面過量表達的特性，將抗CD71單抗與蓖麻毒蛋白A鏈進行偶聯，構建新型免疫毒素。免疫毒素的制備有化學交聯法和基因工程融合法。本研究采取化學交聯法，以N-琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫）丙酸酯［N-succinimidyl-3-（2-pyridyldithio）-propionate，SPDP］作為交聯劑［15］。

本實驗應用SPDP作為交聯劑，將RTA和CD71 mab進行偶聯，根據SDS-PAGE結果，顯示成功構建免疫毒素CD71 mab-RTA，及間接ELISA方法顯示免疫毒素構建以后基本不影響免疫反應性。體外細胞毒性實驗結果顯示，IT對兩類細胞的生長抑制作用有明顯的差別，表明對高表達CD71的HepG2細胞，IT依靠CD71mab的靶向定位作用，通過與其特異性結合，導入RTA發揮毒性作用，而LO2細胞因其細胞表面CD71表達量較低，IT與其特異性結合較差，故而殺傷作用較弱。

目前免疫毒素在腫瘤治療方面還存在以下幾個方面的問題：（1）特異性，這是進行腫瘤靶向治療的前提；（2）活性，取決于其半衰期和穩定性，這兩者又取決于免疫毒素的分子結構、偶聯活性及與腫瘤細胞的親和力；（3）免疫原性，這可導致機體出現排斥反應。因此，尋求更為有效的生物毒素及特異性靶向分子，及改進偶聯方式，修飾其中的免疫原性，是免疫毒素將來應用于臨床的關鍵。

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Preparation of anti-CD71 monoclonal antibody with the ricin A chain immunotoxin and it's effect of anti-hepatocellular carcinoma cells in vitro

SHEN Su jian,ZHENG Bo,CAI Zhen zhai,XU Chang lng,XUE Zhan xiong.（The Second Amitated Hospital of Wenzhou medical University, Wenzhou 325000, Zhejiang , China）

【Abstract】ObjectiveAccording to the cytotoxicity of ricin A chain（RTA）and the target localization feature of CD71 monoclonal antibody（Mab），to research the effect of anti-hepatoma carcinoma cell in vitro of the immunotoxin（IT）composed by RTA and CD71 Mab.MethodsTaking SPDP as the coupling agent，RTApurified from castor bean was linked with CD71 Mab.After further purification，the construction of IT was detected by SDS-PAGE.The immunoreactivity was detected by indirect ELISA.The cytotoxicity in vitro was detected by WST-1 method.ResultsRTA was successfully purified by series of steps fromricin crude，such as grinding，filtration，affinity chromatography，gel chromatography，ion exchange chromatography and so on.The immunotoxin was constructed successfully，and there were two experimental results in the electropherogram of SDS-PAGE.Under non-reducing conditions，it migrated as a molecular weight exceeded about 116 kD；under reducing state，it migrated as three electrophoretic bands，which located at approximately 55 kD，32 kD and 28 kD.The experimental result of indirect ELISA showed that the curves of IT and Mab had the same trend，but the absorbance of IT was lower than that of Mab in a series of concentration gradient.By WST-1 method，in a series of concentration gradient，IT displayed a different cytotoxicity between HepG2cell and LO2cell（＜0.05）.ConclusionsIT retained a major part of the immunoreactivity.IT displayed a different cytotoxicity between HepG2and LO2cells.IT played a specific role in suppressing the multiplication of the hepatoma carcinoma cell and had a good prospect in liver cancer treatment.

Liver neoplasm；Carcinoma；Immunotoxin；Ricin；CD71

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.003

R735.7

A

1671-0800（2016）07-0847-04

325000浙江省溫州，溫州醫科大學附屬第二醫院通信作者： 薛戰雄，Email：xuezhanxiong@126.com

鑒于目前肝癌治療方式的效果不佳及副作用較大，尋求有效且針對性強的治療方式是醫學界的努力方向之一。免疫毒素（IT）是近年來新興的腫瘤靶向治療方法，為利用抗特定腫瘤細胞的單克隆抗體與腫瘤細胞的特異性結合的特點，將生物毒素（主要是細菌毒素、動物毒素和植物毒素）與該單抗進行偶聯，靶向攻擊腫瘤細胞，而其對正常組織細胞的殺傷性較小［1-2］。蓖麻毒蛋白由兩條多肽鏈（RTA和RTB）組成，其中RTA為毒性多肽，RTB具有定位功能，但由于真核細胞表面普遍含有半乳糖基的糖蛋白或糖酯，故蓖麻毒蛋白對所有哺乳動物真核細胞都有毒害作用。如何有效發揮蓖麻毒蛋白的細胞毒作用，使其只作用于肝癌細胞，而不損傷正常肝細胞，成為肝癌治療方面的研究難點。轉鐵蛋白受體（TFR/ CD71）在肝癌細胞上的表達水平明顯高于正常細胞。以上述研究背景為基礎，本研究采用N-琥珀酰胺-3-（2-吡啶二硫）丙酸酯［N-succinimidyl-3-（2-pyridyldithio）-propionate，SPDP］為偶聯劑制備免疫毒素（CD71mab-RTA），并初步評價其體外抗肝癌細胞效應。現將結果報道如下。

2015-08-12（本文編輯：姜曉慶）