血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單核苷酸多態(tài)性與動(dòng)脈硬化性腦梗死的相關(guān)性研究

應(yīng)濤，方晶晶，陶靜，黃麗

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單核苷酸多態(tài)性與動(dòng)脈硬化性腦梗死的相關(guān)性研究

應(yīng)濤，方晶晶，陶靜，黃麗

目的研究血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）單核苷酸多態(tài)性（SNP）與動(dòng)脈硬化性腦梗死（ACI）的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)，分析 100例 ACI患者與 100例健康對(duì)照組VEGF-460T/C、+405G/C與+936C/T基因的多態(tài)性。結(jié)果ACI組的三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽同醇（LDLC）、血壓均高于對(duì)照組（均P＜0.05）；兩組VEGF+936C/T的基因型和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），-460T/C與+405G/C基因型和等位基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；攜帶有936T的人群患ACI的機(jī)會(huì)與非攜帶者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而ACI發(fā)病機(jī)會(huì)在攜帶有-460C和405C基因患者與非攜帶者差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論VEGF+936C/T核苷酸多態(tài)性與ACI相關(guān)，其基因型是ACI易感基因型，VEGF-460T/C、+405G/C與ACI無(wú)關(guān)。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；腦梗塞，動(dòng)脈硬化性；單核苷酸多態(tài)性

動(dòng)脈硬化性腦梗死（ACI），是腦部動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成，使腦血管管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致急性腦供血不足，引起局部腦組織缺血性壞死。患者可出現(xiàn)偏癱、失語(yǔ)等腦局灶性損害癥狀，是影響中老年人生活質(zhì)量和生存率下降的重要原因［1］。然而，目前ACI發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制仍不明確，遺傳的易感性被認(rèn)為是 ACI發(fā)病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子，可增加血管通透性，保護(hù)血管。已發(fā)現(xiàn)ACI患者血漿中VEGF水平較正常人群高，VEGF基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)的不同基因型可顯著影響VEGF的表達(dá)［2-3］。因此，本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PC-RFLP）技術(shù)，對(duì)ACI患者 VEGF基因+936C/T、-460T/C 與+405G/C的多態(tài)性進(jìn)行分析，探討ACI發(fā)病機(jī)制。報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2015年1月至2016年1月寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的ACI患者100例，符合1995年第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的ACI的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男55例，女45例；年齡50～80歲，平均（65±10）歲。另選同期健康體檢者100例為對(duì)照組，其中男60例，女40例；年齡5～80歲，平均（63±9）歲。兩組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2方法所有受檢者均禁食12～14h，晨起空腹抽取靜脈血5 ml，常規(guī)分離血清，其中20l用作DNA提取，其余行三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測(cè)定，并且測(cè)量血壓。

1.2.1試劑和儀器基因組抽提試劑盒和引物均購(gòu)自上海生工生物工程服務(wù)有限公司，Roche 480實(shí)時(shí)熒光PCR儀和上海天能科技有限公司電泳槽、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2.2基因分型取血清 200l，按UNIQ-10柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA。用PC-RFLP方法分析 VEGF-460T/C、+405G/C與+936C/T的多態(tài)性。引物序列見表1。擴(kuò)增條件為94℃5 min 1個(gè)循環(huán)，94℃，30 s→58℃（VEGF-460T/C）62℃，30 s→72℃，30 s 30個(gè)循環(huán)，72℃5 min 1個(gè)循環(huán)，其中VEGF-460T/C退火溫度為62℃。1.3統(tǒng)計(jì)方法用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組比較用 檢驗(yàn)；基因型的Hardy-Weinberg平衡采用X2檢驗(yàn)；研究不同基因型與ACI間的關(guān)系用多元Logistic回歸分析；調(diào)整的危險(xiǎn)因素關(guān)聯(lián)程度用相對(duì)危險(xiǎn)度（CR）及其95%可信區(qū)間（CI）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1VEGF-460T/C、+405G/C與+936C/T引物序列

2　結(jié)果

2.1ACI組與對(duì)照組臨床資料分析

ACI組的TG、LDL-C、血壓均高于對(duì)照組（均P＜0.05），見表2。2.2Hardy-Weinberg平衡驗(yàn)ACI組的VEGF+936C/T、-460T/C與+405G/C 3個(gè)位點(diǎn)基因分型理論頻數(shù)合和觀察頻數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。見表3。

表2　腦梗死組與對(duì)照組一般臨床資料比較

表3ACI組基因型分布Hardy-Weinberg檢驗(yàn)

2.3VEGF+936C/T、-460T/C與+405G/ C位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型分析兩組VEGF+936C/T的基因型和等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2=9.70、6.88，均P＜0.05），見表4。VEGF-460C等、VEGF+405C等位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布情況差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2≤2.56，均P＞0.05）。見表5、6。

2.4VEGF SNP與ACI的關(guān)系帶有936T的人群患ACI的機(jī)會(huì)與非攜帶者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而ACI發(fā)病機(jī)會(huì)在攜帶有-460C和405C基因患者與非攜帶者差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表7。

表4　兩組中VEGF+936C/T位點(diǎn)等位基因頻率和基因型分析

表5　兩組中VEGF-460T/C位點(diǎn)等位基因頻率和基因型分析

表6　兩組中VEGF+405G/C位點(diǎn)等位基因頻率和基因型分析

3　討論

VEGF是胱氨酸生長(zhǎng)因子超家族的一員，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)血管生成的作用［4］，其 SNP位點(diǎn)以VEGF+936C/T、-460T/C與+405G/C最重要［5］，這些 SNP位點(diǎn)可能通過(guò)影響VEGF的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后［6-7］。

ACI發(fā)病是一個(gè)較復(fù)雜病理生理過(guò)程，環(huán)境因素和遺傳因素被認(rèn)為是ACI發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。本研究中，ACI組的TG、LDL-C、血壓均高于對(duì)照組（均P＜0.05），表明環(huán)境因素中高脂血癥和高血壓等都是 ACI發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。Hardy-Weinberg平衡法則是群體遺傳學(xué)中的一個(gè)基本定律，它是進(jìn)行人群基因多態(tài)性研究的前提和基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ACI組的VEGF+936C/T、-460T/C 與+405G/C 3個(gè)位點(diǎn)基因分型結(jié)果符合Hardy-Weinberg平衡，表明結(jié)果具有群體代表性；VEGF+936C/T在ACI組中的分布頻率高于對(duì)照組（P＜0.05），攜帶VEGF936T者患ACI的危險(xiǎn)性是不攜帶者的2.181倍（?2.18，95%?1.22 ～3.93），可見VEGF+936C/T是ACI的易感基因型，VEGF+936C/T SNP與ACI有關(guān)系。有學(xué)者也報(bào)道中國(guó)漢族人群中VEGF+936C/T基因型可能與腦梗死發(fā)病有關(guān)［8-9］。Hugo等［10］研究表明VEGF+ 936C/T SNP可通過(guò)影響VEGF的表達(dá)，從而影響血管的修復(fù)能力，使攜帶者對(duì)ACI易感，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。兩組VEGF-460T/C和VEGF+405G/C的基因型和等位基因分布頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），提示VEGF-460T/C和 VEGF+405G/C SNP 與ACI可能沒(méi)有關(guān)聯(lián)，與李天煉等［9］研究結(jié)果相符。

表7 兩組中VEGF936C/T、-460T/C、405G/ C基因多態(tài)性位點(diǎn)與ACI的關(guān)系

［1］Morgan L，Humphries SE.The genetics of stroke［J］.Curt OpinLipidol，2005，16（2）：193-199.

［2］WangY，GalvanV，GorostizaO，eta1.Vascular endothelial growth factor improves recovery of nsorimotor and cognitive deficits after fecal cerebral ischemia in the mq ［J］.Brain Res，2006，l115（1）：186-193.

［3］LeeH J，KimKS，ParkIH，eta1.Humanneural stem cells overex-pressingVEGF provideneuroprotection.angiogenesisandfunctionalre-coveryinmousestrokemodeq［J］.Plos One，2007，2（1）：156.

［4］Tischher E，Mitchell R，Hartman T，et a1. The human gene for Vascular endothelial growth factor.Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing ［J］.JBiolChem，1991，266（18）：11947-11954.

［5］KimDH，XuW，Kamel-ReidS，eta1.Clinieal relevanceof vascular endothelialgrowthfactor（VEGFA）andVEGFreceptor（VEGFR2）gene polymorphism on the treatment outcomefollowingimatinil，therapy［J］.Ann Oncol，2010，21（6）：1179-1188.

［6］ChurchillAJ，CarterJG，RamsdenC，eta1. VEGFpolymorphismsareassociatedwith∞verityofdiabeticretinopathy［J］.InvestOphthalmol Vis Sci，2008，49（8）：3611-3616.

［7］CostnR，Gilalmrt-EstellsJ，RamnLA，eta1. Vascularendothelialgrowthfactorpolymorphisms（-460C/T，+405G/Cand936C/T）andendometriosis：theirinfluenceonvaseudarendothelialgrowthfactorexpression［J］.FenilSteril，2009，92（4）：1214-1220.

［8］劉鳳君，戴悅，劉曉琳，等.VEGF基因936C/ T多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)聯(lián)研究［J］.中國(guó)急救復(fù)蘇與災(zāi)害醫(yī)學(xué)雜志，2007，2（2）：135-141.

［9］李天煉，廖小平，鄧益東，等.VEGF基因多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系［J］.山東醫(yī)藥，2009，49（48）：84-85.

［10］Hugo J，Myriam B，Antia B，et a1.Hypoxia-induced vascular endothelial growth factor expressio precedes neovascularizationaftercerebralischemia［J］.AmJPathol，2000，156（3）：965-976.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.017

R743.33

A

1671-0800（2016）07-0876-03

寧波大學(xué) 2015校級(jí)課題（XYY15003）

315020寧波，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

應(yīng)濤，Email：nbyingtao@foxmail.com

2016-03-15