腫瘤壞死因子-α基因多態(tài)性與中國漢族人群乙肝病毒感染的相關(guān)性研究*

劉麗軍

（西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712082）

論著

腫瘤壞死因子-α基因多態(tài)性與中國漢族人群乙肝病毒感染的相關(guān)性研究*

劉麗軍

（西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712082）

目的探討中國漢族人群腫瘤壞死因子-α（TN F-α）基因單核苷酸多態(tài)性（r s1800629和r s361525）與乙型肝炎病毒（H B V）感染的相關(guān)性。方法用T a q M a n探針對納入的1 097例樣本進(jìn)行TN F-α、r s1800629和r s361525位點(diǎn)多態(tài)性檢測，血樣本包括429例慢性H B V感染者（C H組）、429例乙肝感染后自發(fā)清除者（S R組）及239例健康對照者（H C組）。結(jié)果①C H組與S R組比較，r s1800629 G A基因型與G等位基因與感染后病毒的自發(fā)清除有關(guān)［基因型：O R＾=0.369，P=0.000；等位基因：O R＾=2.210，P=0.000；顯性模型（GG v s G A+AA）：O R＾=0.536，P=0.000］。②C H組與S R組比較，SN P r s361525 G A基因型或A等位基因與感染后病毒的自發(fā)清除密切相關(guān)［基因型：O R＾=0.288，P=0.000；等位基因：O R＾=0.549，P=0.000；顯性模型（GG v s G A+AA）：O R＾=0.634，P=0.000］。結(jié)論TN F-α基因多態(tài)性與中國漢族人群H B V病毒感染后的自發(fā)清除密切相關(guān)。

乙型肝炎；單核苷酸多態(tài)性；腫瘤壞死因子-α基因

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B v ir u s，HBV）感染是我國面臨的一個嚴(yán)峻的衛(wèi)生問題。盡管大部分的感染者能自發(fā)清除病毒，但仍有約5%～10%的感染者發(fā)展為慢性感染［1］。半數(shù)以上慢性HBV感染患者病情穩(wěn)定，可表現(xiàn)為無癥狀攜帶或輕度慢性肝炎。部分患者則會進(jìn)展為肝硬化或肝癌等嚴(yán)重的肝病［2］。影響HBV感染結(jié)局的因素主要是宿主、病毒及環(huán)境3大因素，越來越多的證據(jù)表明宿主遺傳因素在慢性HBV感染中發(fā)揮重要作用［3］。

腫瘤壞死因子-α（t u mor necrosis f actor-α，TN F-α）作為一種重要的細(xì)胞因子，被證實(shí)參與HBV病毒清除的過程［4］。近年來有報道稱，TN F-α啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1800629與rs361525與HBV慢性感染有關(guān)［5-7］，但結(jié)論不一致。因此，本研究通過病例對照方法來探討TN F-α啟動子區(qū)基因多態(tài)性（rs1800629和rs361525）與乙型肝炎病毒感染結(jié)局的相關(guān)性。

1　資料與方法

1.1研究對象

選取2011年1月-2015年6月就診于西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院的無血緣關(guān)系的患者。其中包括正常對照組（H C組）、自發(fā)清除組（SR組）、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，C HB）（C H組）、乙肝肝硬化（cirrhosis o f li v er，L C）、乙肝肝癌（hepatocell u lar carcinoma，H CC）。診斷標(biāo)準(zhǔn)參見《慢性乙型肝炎防治指南》。排除標(biāo)準(zhǔn)：①HBV血清兩對半標(biāo)志物不明確者；②僅有乙型肝炎表面抗體陽性（+）的HBV疫苗接種者；③艾滋病或其他非HBV肝炎病毒感染者；④嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、非H CC腫瘤等其他肝臟疾病；⑤如自身免疫型肝病、原發(fā)性膽汁性肝硬化等；⑥非漢族人。本研究得到西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，所有受試者簽署書面的知情同意書。

1.2樣本及生化指標(biāo)的采集

采集每個受試者血液約3ml，置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^問卷調(diào)查方式收集其年齡、性別等基本情況。乙肝兩對半、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotrans f erase，A L T）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotrans f erase，A S T）、血清總膽紅素（total bilir u bin，T B I L）及乙肝病毒的脫氧核糖核酸（hepatitis B v ir u s-deo x yribon u cleic acid，HBV-DN A）水平的測定由本院檢驗(yàn)科完成。

1.3DN A的提取與基因型分析

使用W i z ard G enomic DN A純化試劑盒（美國P rome g a公司）提取外周血基因組DN A。NanoDrop 2000（美國Thermo S cienti f ic公司）測定DN A濃度及光密度值，并稀釋成30 n g/μl備用。單核甘酸多態(tài)性（sin g le n u cleotide polymorphism，S N P）rs1800629 與rs361525分型采用Ta q M an探針法（美國A pplied B iosystems公司）。Ta q M an等位基因鑒別實(shí)驗(yàn)由A B I 7500快速實(shí)時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，R eal-time q PC R）系統(tǒng)完成（美國A pplied B iosystems公司）。其中每96孔設(shè)置1個陰性對照和1個陽性對照。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl，含30n g/μl DN A2μl，master mi x 10μl，primer-probe mi x 0.5μl及DN A ase-f ree w ater 7.5μl。PC R反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，92℃變性15 s，60℃退火1min，共39個循環(huán)。隨機(jī)選取10%樣本用同一方法重復(fù)驗(yàn)證以保證分型準(zhǔn)確，基因分型錯誤率＜0.1%。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用S P SS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，H ardy-W einber g遺傳平衡由 HW E軟件完成，用S t u dent't檢驗(yàn)或M ann-W hitney U檢驗(yàn)，3組計量資料比較用方差分析；計數(shù)資料以用百分比或率表示，用χ2檢驗(yàn)；基因型及基因模型使用二分類L o g istic回歸校正年齡與性別后進(jìn)行比較。使用H aplo v ie w so f t w are（v4.2）軟件進(jìn)行單體型分析。考慮到多重檢驗(yàn)的問題，P＜0.0125（0.05/4）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1基本資料及H ar d y-We i n ber g遺傳平衡

2.1.1基本資料本研究共納入1 097例患者，其中C H組429例，SR組429例，H C組239例。各組年齡比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.080，P=0.923）。3組男女比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=63.210，P=0.000），C H組男性比例高于SR組與H C組。3組A L T、A S T、T B I L、HBV-DN A定量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.049，P=0.005；F=49.216，P=0.000；F=7.594，P=0.023；F= 15.004，P=0.005），C H組高于SR組及H C組。見表1。

2.1.2H a rd y-W e in b e r g遺傳平衡rs1800629與rs361525均符合H ardy-W einber g遺傳平衡（SR組：rs1800629位點(diǎn)P=0.085，rs361525位點(diǎn)P=0.199；H C組：rs1800629位點(diǎn)P=0.136，rs361525位點(diǎn)P= 0.451）。

2.2TN F-α rs1800629基因型與乙肝感染結(jié)局的關(guān)系

rs1800629 G是各組中最常見的等位基因。攜帶rs1800629 G A基因型與G等位基因有利于感染后病毒的自發(fā)清除，該保護(hù)性作用在顯性遺傳模型中仍存在［C H組v s SR組基因型：O R＾=0.369，P=0.000；等位基因：O R＾=2.210，P=0.000；顯性模型（GG v s G A+ AA）：O R＾=0.536，P=0.000］（見表2）。在疾病進(jìn)展方面，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性與疾病相關(guān)（見表3）。

2.3TN F-α rs361525基因型與乙肝感染結(jié)局的關(guān)系

攜帶G A基因型或A等位基因有利于感染后病毒的自發(fā)清除［C H組v s SR組基因型：O R＾=0.288，P= 0.000；等位基因：O R＾=0.549，P=0.000；顯性模型（GG v s G A+AA）：O R＾=0.634，P=0.000］（見表2）。在疾病進(jìn)展方面，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性與疾病相關(guān)（見表3）。

2.4TN F-α基因單體型與乙肝病毒感染結(jié)局的關(guān)系

表1　各組納入研究者的人口學(xué)及臨床特征比較

表2　慢性乙肝感染與TN F-α基因型的關(guān)系

表3　慢乙肝進(jìn)展與TN F-α基因多態(tài)性的關(guān)系

考慮到單體型在解釋多態(tài)性與疾病相關(guān)性上有更好的說服力，本研究以TN F-α兩位點(diǎn)為基礎(chǔ)構(gòu)建單體型。但未發(fā)現(xiàn)兩個位點(diǎn)之間能夠構(gòu)建單體型。

3　討論

TN F-α是由單核巨噬系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)作用，增加I L-1、I L-8和粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的分泌，提高I L-2R基因表達(dá)的水平，促進(jìn)T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖、分化和產(chǎn)生抗體等作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，TN F-α 基因啟動子區(qū)域內(nèi)rs1800629和rs361525等S N P與丙型肝炎病毒感染、HBV感染及其抗病毒治療應(yīng)答相關(guān)［8-10］。本研究主要探討 TN F-α 基因啟動子區(qū) rs1800629和rs361525位點(diǎn)多態(tài)性與HBV感染結(jié)局的相關(guān)性。

結(jié)果顯示，我國人群TN F-α基因rs1800629和rs361525位點(diǎn)基因型均以GG為主，等位基因頻率G＞A，與相關(guān)研究結(jié)果一致［6，11］。在HBV病毒感染后的自發(fā)清除方面，攜帶rs9275572 G等位基因表現(xiàn)出保護(hù)作用，且該效應(yīng)在顯性模型中也有體現(xiàn)。攜帶rs361525 G A基因型或A等位基因有利于感染后病毒的自發(fā)清除，且該效應(yīng)在顯性模型中同樣得到印證。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人的研究一致［12-14］。rs1800629和rs361525位于TN F-α基因的啟動子區(qū)，不同的等位基因，可能會影響TN F-α啟動子的活性，進(jìn)而影響TN F-α的表達(dá)，從而對HBV感染后的清除過程產(chǎn)生作用。

本研究將 rs1800629和 rs361525結(jié)合探討TN F-α基因多態(tài)性與乙肝感染結(jié)局的關(guān)系。然而，對于這2個位點(diǎn)來說，本研究較之其他研究仍有相悖之處［6，11］，考慮可能存在以下原因：①S N P受種族、地域等因素的影響，導(dǎo)致其遺傳差異顯著，這也是導(dǎo)致該研究與其他文獻(xiàn)報道差異的原因之一。②樣本量與其他混雜因素的存在，例如基因或者環(huán)境因素。本研究也存在一定的不足之處，例如納入研究的樣本量不夠多，這在一定程度上降低實(shí)驗(yàn)的信度。今后需要更大樣本量、設(shè)計更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，本研究表明，中國人TN F-α基因多態(tài)性與HBV病毒感染后病毒的自發(fā)清除有關(guān)，一定程度上為慢性乙型肝炎的早預(yù)防和高應(yīng)答率的治療奠定基礎(chǔ)。

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（童穎丹 編輯）

Association between TNF-αgene polymorphism s and chronic hepatitis B virus infection*

Li-jun Liu
（Medical College of Xizang Minzu University，Xianyang，Shannxi 712082，China）

Objective To assess the relation between two single nucleotide polymorphisms（rs1800629 and rs361525）of TNF-αgene and the outcomes of HBV infection in Chinese Han population．M ethods TNF-α （rs1800629 and rs361525）was genotyped by TaqMan probe method in 1，097 subjects，including 429 patients with chronic HBV infection（CH），429 HBV spontaneous clearance subjects（SR）and 239 healthy control individuals（HC）.Results rs1800629 GA genotype and G allele showed significant protective effect on HBV spontaneous clearance［CH vs SR:genotype:O R＾=0.369，P=0.000；allele:O R＾=2.210，P=0.000；dominant model （GG vs GA+AA）:O R＾=0.536，P=0.000］.SNP rs361525 showed a significant association with HBV spontaneous clearance.The rs361525 GA genotype and A allele played a protective role［CH vs SR:genotype:O R＾= 0.288，P=0.000；allele:O R＾=0.549，P=0.000；dominant model （GG vs GA+AA）:O R＾=0.634，P=0.000］. Conclusions TNF-αgene polymorphisms are associated with HBV spontaneous clearance．

hepatitis B；single nucleotide polymorphism；tumor necrosis factor-αgene

R 512.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.016

1005-8982（2016）15-0087-04

2016-01-06

西藏自治區(qū)科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（No：Z2014A09G2-3）；西藏自治區(qū)科技廳項(xiàng)目（No：2015ZR-13-19）