Not c h1在肌成纖維細胞轉化中的作用及表達變化*

于秀文，曾林祥

（1.浙江省杭州市蕭山區第一人民醫院 呼吸科，浙江 杭州 311200；2.南昌大學第二附屬醫院 呼吸科，江西 南昌 330006）

論著

Not c h1在肌成纖維細胞轉化中的作用及表達變化*

于秀文1，曾林祥2

（1.浙江省杭州市蕭山區第一人民醫院 呼吸科，浙江 杭州 311200；2.南昌大學第二附屬醫院 呼吸科，江西 南昌 330006）

目的探討在成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞過程中，N ot c h1表達的變化規律，以及γ-分泌酶抑制劑（DA P T）抑制N ot c h信號后，對細胞轉化的影響。方法取新出生2～3 d SD大鼠的肺組織，用胰酶消化法分離肺成纖維細胞，再將培養至第3代的細胞分為3組：對照組、轉化生長因子-β1（T G F-β1）組、T G F-β1+ DA P T組。對照組為空白對照，T G F-β1組加入5ng/m l T G F-β1，T G F-β1+DA P T組同時加入5 ng/m l T G F-β1及5μm ol/L DA P T。采用免疫細胞化學法對α-平滑肌肌動蛋白（α-S M A）的表達變化進行檢測。同時通過逆轉錄聚合酶鏈反應（R T-P C R）及W e s t e r n blot檢測N ot c h1 mR NA和蛋白的表達變化。結果α-S M A免疫細胞化學結果表明，對照組大部分細胞無染色，而T G F-β1組則可見大部分細胞內有黃色和棕黃色顆粒及條紋，DA P T組和對照組無明顯差異。對照組、T G F-β1組、T G F-β1+DA P T組N ot c h1 mR NA表達量分別為（0.278±0.022）、（0.783±0.018）和（0.313±0.029），對照組與T G F-β1組、T G F-β1組與T G F-β1+DA P T組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），對照組與T G F-β1+DA P T組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。對照組、T G F-β1組、T G F-β1+DA P T組N ot c h1蛋白表達量分別為（0.312±0.019）、（0.701±0.026）和（0.345±0.022），組間比較結果同N ot c h1 mR NA。結論N ot c h1可以促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，進而促進肺纖維化。

N ot c h1；α-平滑肌肌動蛋白；肌成纖維細胞；肺纖維化

Notch信號通路是一個調節細胞分化的經典信號通路，1917年首次在果蠅體內發現，在多種動物中都有其同源分子的存在，脊椎動物細胞主要是對于4 種Notch受體及5種Notch配體有相應的表達［1］。Notch信號通路生物學作用的發揮需要經過3步酶切作用，以及多種信號分子的聯鎖反應，而γ-分泌酶復合體的酶切作用則是其中最關鍵的環節，用γ-分泌酶抑制劑｛N-［N-（3，5-di f l u orophenacetyl）-L-alanyl］-（S）-phenyl g lycinet-b u tylester，D A P T｝能夠對于γ-分泌酶復合體進行抑制，也就阻斷Notch信號通路。

Notch信號通路在多種組織器官的發育和動態平衡中發揮重要作用，可以通過控制呼吸系統中多種細胞的功能和分化的方式，來調節肺的發育和維持成人體內呼吸道細胞種類的平衡［2］，同時在慢性肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化、肺動脈高壓、哮喘和肺癌中發揮重要作用［3］。近年來，有關Notch信號通路在肺損傷及肺纖維化中的作用機制亦是研究的熱點，但仍然不甚明確。本研究旨在探討成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞過程中，Notch1的作用及表達變化，為臨床治療肺纖維化提供理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗試劑

兔抗山羊Notch1多克隆二抗（美國S anta cr uz公司），山羊抗鼠Notch1多克隆一抗（美國S anta cr uz公司），免疫組織化學法試劑（北京中衫金橋生物技術有限公司），鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth m u scle actin，α-S M A）單克隆抗體（武漢博士德公司），鼠β-肌動蛋白多克隆抗體、蛋白抽提試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，B C A）法蛋白定量試劑盒（美國P ierce公司），彩色預染蛋白質分子量標準（上海碧云天生物技術研究所），DN A M ar k er（北京天根生物科學技術有限公司），逆轉錄聚合酶鏈反應（re v erse transcription-polymerase chain reaction，R T-PC R）試劑盒（大連寶生生物工程有限公司），轉化生長因子-β1（trans f ormin g g ro w th f actor-β1，T G F-β1）（美國P eproTech公司），D A P T（美國S i g ma公司），總R N A提取試劑。

1.2細胞分組

試驗動物為江西中醫學院動物房所提供的出生2～3 d的S D大鼠乳鼠（批號：J Z D W N O：2011-0093）。取其肺組織培養為肺成纖維細胞，具體培養方法參照文獻并加以改進［4］。取第3代成纖維細胞，接種于6孔板，細胞密度達到85%～90%時，無血清同步24h。把細胞分為對照組、T G F-β1組和T G F-β1+D A P T組。其中，對照組為空白對照，在T G F-β1組中，T G F-β1的量為5 n g/ml，T G F-β1+D A P T組先加入終濃度為5μmol/l的D A P T，30min后再加入終濃度為5 n g/ml的T G F-β1，每組復孔3個，觀察24 h后，分別用于提取細胞總R N A及總蛋白。實驗重復3次。

1.3α-SM A免疫細胞化學實驗

將18mm×18mm蓋玻片置于6孔板內，同時在六孔板中進行第3代成纖維細胞的接種，其密度為每孔約1×105個細胞，按上述方法將細胞分為3組，每組復孔3個，觀察24 h后取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定細胞，再用3%雙氧水H2O2處理細胞10 min，封閉內源性過氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate b uff er saline，P B S）沖洗3次，10%動物血清封閉10min，降低非特異性結合，一抗4℃過夜，P B S沖洗3次，室溫下孵育二抗1 h，鏈霉親和素-生物素復合物（strept a v idin-biotin comple x，S A B C）復合物室溫下30min，二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片后，光鏡下觀察各組染色變化，α-S M A陽性標準以出現棕黃色顆粒或條紋為依據，隨機觀察10個高倍視野，計算陽性率。

1.4RT-PCR反應檢測Not c h1 m RN A

通過胰酶消化法實現對于六孔板內細胞的提取，Tri z ol法提取細胞總R N A并逆轉錄成cDN A。Notch1引物由美國I n v itro g en生命技術公司設計并合成，正向引物為：5'-G AA GG AA CG A GCC T GGG T GC C T G T A-3'，反向引物為：5'-T GGC T GGG A GC A T C T C AA GCC T-3'，擴增引物268 bp。反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1min，共30次循環，總時間8min。在進行電泳時，取6μl PC R產物進行瓊脂糖電泳，對于結果通過凝膠成像分析系統的紫外分光成像進行相應分析，對于積分吸光度進行記錄。

1.5Wester n blot檢測Not c h1蛋白

使用單去污細胞裂解液提取6孔板內細胞總蛋白，沸水煮10min使蛋白變性，冷卻至室溫后，置入-20℃冰箱冷凍保存備用。B C A法進行蛋白定量，取變性后的蛋白質樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodi u m dodecyl s u l f ate-polyacrylamide g elelectrophoresis，S D S-P A G E）電泳，每個泳道上樣量為30μg，用垂直電泳儀進行電泳后取下凝膠，將蛋白轉移至0.45mm醋酸纖維膜上，依次進行封閉、洗膜，加一抗在4℃孵育過夜（稀釋至1∶200），二抗室溫孵育2 h（稀釋至1∶5 000）。通過化學發光法進行顯影，將Notch1和β-肌動蛋白的灰度值進行相應的標準化后，計算Notch1蛋白表達的相對半定量比值。

1.6統計學方法

采用S P SS 18.0統計軟件進行數據分析，計量分析用均數±標準差（x±s）表示，多個樣本均數比較用單因素方差分析，組間比較用LS D-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1α-SM A免疫細胞化學

在對照組中，染色的細胞只占一小部分，能夠看到少部分細胞中有淡黃色的顆粒或者是條紋，但是黃色以及棕黃色的顆粒和條紋卻是極少的。但是T G F-β1組出現黃色以及棕黃色顆粒及條紋的細胞占據大多數。對照組、T G F-β1組、T G F-β1+D A P T組的α-S M A免疫細胞化學陽性率分別為（0.314± 0.019）%、（0.704±0.022）%和（0.339±0.026）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=10.172，P=0.072）。T G F-β1組與對照組和T G F-β1+D A P T組比較，經LS D-t檢驗，差異有統計學意義（t=23.176和18.354，P=0.023和0.034），T G F-β1組較對照組和T G F-β1+ D A P T組的α-S M A表達增加。T G F-β1+D A P T組與對照組比較，經LS D-t檢驗，差異無統計學意義（t= 2.573，P=0.112）。見圖1。

圖1　α-SM A細胞免疫化學電鏡圖 （×30）

2.2Not c h1 m RN A的表達

在對于R T-PC R產物進行電泳時，在268和207bp處，Notch1與β-肌動蛋白有著一定的表達條帶。對照組、T G F-β1+D A P T組、T G F-β1組的 Notch1 m R N A表達量分別為（0.278±0.022）、（0.313±0.029）和（0.783±0.018），差異有統計學意義，T G F-β1組Notch1 m R N A表達量升高，而對照組與D A P T組比較差異無統計學意義。見附表和圖2。

2.3Not c h1蛋白的表達

Notch1蛋白在120 k D處表達，在對照組（0.312±0.019）僅有少量Notch1表達。T G F-β1+D A P T組（0.345±0.022）與對照組的Notch1蛋白表達比較，差異無統計學意義。T G F-β1組（0.701±0.026）較對照組及T G F-β1+D A P T組中Notch1表達升高，差異有統計學意義。見附表和圖3。

圖2　RT-PCR反應檢測各組細胞中Not c h1 m RN A表達的變化

附表　Not c h1 m RN A積分吸光度值比較 （n=3

附表　Not c h1 m RN A積分吸光度值比較 （n=3

組別蛋白對照組　0 . 2 7 8 ± 0 . 0 2 2 　0 . 3 1 2 ± 0 . 0 1 9 T G F -β1組　0 . 7 8 3 ± 0 . 0 1 8 　0 . 7 0 1 ± 0 . 0 2 6 T G F -β1+ D A P T組　0 . 3 1 3 ± 0 . 0 2 9 　0 . 3 4 5 ± 0 . 0 2 2 F值　1 2 . 8 2 9 　9 . 7 5 4 P值　0 . 0 6 9 　0 . 0 8 0 t1值　2 7 . 6 7 0 　2 1 . 3 4 4 P1值　0 . 0 1 5 　0 . 0 2 8 t2值　1 . 8 1 3 　1 . 9 1 7 P2值　0 . 2 0 2 　0 . 1 8 7 t3值　2 5 . 7 4 3 　1 9 . 5 1 2 P3值　0 . 0 1 7 　0 . 0 3 0 m R N A

圖3　Wester n blot檢測各組細胞中Not c h1蛋白表達的變化

3　討論

肺纖維化是多種肺部疾病的共同結局，其主要病理特征是細胞外基質的沉積，以及肺泡結構的破壞，如肺泡囊腫的形成。而細胞外基質的主要成分是Ⅰ型膠原蛋白。研究表明，肌成纖維細胞是產生Ⅰ型膠原蛋白的主要細胞，也是肺纖維化的責任細胞［5］，而對于肌成纖維細胞來說，其表型的標志就是α-平滑肌肌動蛋白。而T G F-β1主要的作用是能夠促進肺內成纖維細胞的轉化，將其轉化為肌成纖維細胞［6］，這在本研究中亦得到證實。α-S M A免疫細胞化學結果顯示，T G F-β1組可見大部分細胞內有黃色和棕黃色顆粒及條紋，α-S M A表達較對照組明顯增加，電鏡下細胞內亦可見大量微絲束，提示T G F-β1可以促使成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞。

Notch信號通路與肺纖維化的發生、發展密切相關［7］，其通過多種途徑干預肺纖維化的病理生理過程，同時可以直接促進Ⅰ型膠原蛋白的表達。在肺纖維化患者的肺組織中，可見明顯呈蜂巢樣改變的肺泡囊腫，同時可以檢測到Notch信號的過度表達。肺損傷后的結局是自我修復，還是發展為肺纖維化，可能部分取決于譜系陰性上皮干/祖細胞中的Notch信號通路［8］。P A U L等［9］證實活性氧簇（reacti v e o x y g en species，R O S）通過轉錄因子Nr f2依賴的方式激活Notch信號通路，從而促進氣道基底干細胞的自我更新，啟動清除細胞內活性氧的抗氧化程序。而這種氧化還原機制對肺內干細胞的生物學功能具有重要意義，比如肺損傷、肺纖維化、肺癌等。HU等［10］利用基因敲除及報告基因等方法證實在小鼠L929細胞及人胚肺成纖維細胞（H u man l u n g f ibroblasts，M R C-5）中，Notch信號通過H es1依賴方式調控成纖維細胞表達C ol1α1及C ol1α2，從而上調Ⅰ型膠原蛋白的表達，促進肺纖維化。

Notch信號通路可以促進肌成纖維細胞的表達。A OY A GI-I K ED A等［11］用免疫組織化學法證實，不管是在博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中，還是在特發性肺纖維化的患者肺組織樣本中，Notch信號在肌成纖維細胞中的表達都明顯增強。研究還表明，Notch通過T G F-β-S mad3的途徑激活在肺泡上皮細胞中輻射敏感啟動子（radiation sensiti v e promoter，C ar G）依賴性和 T淋巴細胞抗原表位（Tlymphocyteepitope，T C E）依賴性的平滑肌肌動蛋白基因轉錄，以此來誘導肌成纖維細胞的分化［11］。本研究結果提示，在T G F-β1誘導生成的肌成纖維細胞中，Notch1表達較對照組明顯增加，差異有統計學意義，說明Notch1與肌成纖維細胞的生成相關。同時當D A P T抑制Notch1后，肌成纖維細胞表型標志α-S M A表達明顯降低，提示抑制Notch1可以抑制肌成纖維細胞的生成。進而筆者推測，T G F-β1可能通過活化Notch信號促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，阻斷Notch信號可以抑制這種轉化，即抑制肺纖維化的形成。

綜上所述，T G F-β1可以促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，在肌成纖維細胞中，Notch1表達升高，D A P T阻斷Notch后，可以抑制肌成纖維細胞的生成，其表型標志物α-S M A明顯降低。由此可見，Notch信號通路在肌成纖維細胞生成以及肺纖維化中發揮著重要作用，阻斷Notch信號可能成為治療肺纖維化的新靶點。

［1］T H I B A U T Q，JU L I E D，S TE P H A N I E C，et al.I n f lammation dysre g u lates Notch si g nalin g in endothelial cells:I mplicationo f Notch2 and Notch4 to endothelial dys fu nction［J］.B iochemical P harmacolo g y，2010，80:2032-2041.

［2］Z H A N G S，L O C H A J，R A DT K E F，et al.J a gg edl is the ma j or re g u lator o f Notch-dependent cell f ate in pro x imal air w ays［J］.De v Dyn，2013，242（6）:678-686.

［3］X U K，M O G H A L N，E G A N S E.Notch si g nalin g in l u n g de v elopment and disease［J］.A d v E x p M ed B iol，2012，727:89-98.

［4］于秀文，曾林祥.Notch信號通路對肌成纖維細胞轉化中α-S M A表達變化的影響［J］.中國現代醫學雜志，2013，23（13）:11-14.

［5］E M B L O M-C A LL A H A N M C，C HH I N A M K，S H L OB I N O A，et al.G enomic phenotype o f non-c u lt u red p u lmonary f ibroblasts in idiopathic p u lmonary f ibrosis［J］.G enomics，2010，96:134-145.

［6］C O NTE E，F R U CI A N O M，F A G O NE E，et al.Nhibition o f PI3K pre v ents the proli f eration and di ff erentiation o f h u man l u n g f ibroblasts into myo f ibroblasts:the role o f class I P110 iso f orms［J］. P L o S O ne，2011，6:1-10.

［7］K A V I A N N，S E R V ETT A Z A，M O N G A R ET C，et al.Tar g etin g A D A M-17/Notch si g nalin g abro g ates the de v elopment o f systemic sclerosis ina m u rine model［J］.A rthritis R he u m，2010，62: 3477-3487.

［8］V A U G H A N A E，B R U M W E LL A N，X I Y L，et al.L inea g e-ne gati v e pro g enitors mobili z e to re g enerate l u n g epitheli u m a f ter maj or in j u ry［J］.Nat u re，2015，517（7536）:621-625.

［9］P A U L M K，B I S H T B，D A R M A W A N D O，et al.Dynamic chan g es in intracell u lar R O S le v els re g u late air w ay basal stem cell homeostasis thro u g h Nr f2-dependent Notch si g nalin g［J］.C ell S tem C ell，2014，15（2）:199-214.

［10］HU M，OUY A N G H F，WU CG，et al.Notch si g nalin g re g ulates col1α1 and col1α2 e x pression in air w ay f ibroblasts［J］. E x p B iol M ed，2014，239（12）:1589-1596.

［11］A OY A GI-I K ED A K，M A EN O T，M A T S U I H，et al.Notch ind u ces myo f ibroblast di ff erentiation o f al v eolar epithelial cells v ia trans f ormin g g ro w th f actor-β-S mad3 path w ay［J］.A m J R espir C ell M ol B iol，2011，45（1）:136-144.

（童穎丹 編輯）

Function and expressive change of Notch1 during transformation of m yofibroblasts*

Xiu-wen Yu1，Lin-xiang Zeng2
（1.Department of Respiratory Diseases，the First People's Hospital of Xiaoshan，Hangzhou，Zhejiang 311200，China；2.Department of Respiratory Diseases，the Second Affiliated Hospital，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China）

Objective To study the law of changes of Notch1 expression in the transformative procession from fibroblasts to myofibroblasts and the effect of DAPT inhibition of Notch signal on cell transformation. M ethods The lung tissue was taken from new-born 2 or 3 day Sprague-Dawley rats.Fibroblasts were separated with pancreatin digestion method.The third-generation cultivated cells were divided into three groups: comparison group，TGF-β1group and TGF-β1+DAPT group.The comparison group was labeled as the control group，the TGF-β1group was added with 5 ng/m l TGF-β1，and the TGF-β1+DAPT group was added with 5 ng/m l TGF-β1and 5μmol/L DAPT.Immunocytochemistry was used to assess change ofα-smooth muscle actin（α-SMA）expression.RT-PCR was used to assess change of Notch1 mRNA expression.Western blot was used to assess change of Notch1 protein expression.Statistical software SPSS 18.0 was used for the dataanalysis with t-test.Resultsα-SMA immunocytochemistry demonstrated the majority of cells in the control group were not stained，the majority of cells in the TGF-β1group had yellow and brown-yellow granules and stripes，and there was no obvious difference between the DAPT group and the control group.The Notch1 mRNA expressive value of the control group，the TGF-β1group and the TGF-β1+DAPT group was（0.278± 0.022），（0.783±0.018）and（0.313±0.029）respectively；the Notch1 protein expressive value of the control group，the TGF-β1group and the TGF-β1+DAPT group was（0.312±0.019），（0.701±0.026）and（0.345± 0.022）respectively；there were significant differences in the mRNA and protein levels of Notch1 between the TGF-β1group and both the control and the TGF-β1+DAPT groups（P＜0.05），while the control group and the TGF-β1+DAPT group had no statistical differences（P＞0.05）.Conclusions Notch1 can promote transformation of fibroblasts into myofibroblasts，and then promote pulmonary fibrosis.

Notch1；α-smooth muscle actin；myofibroblast；lung fibrosis

R 363

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.011

1005-8982（2016）15-0060-05

2015-09-16

江西省自然科學基金（No：20132B A B205014）

曾林祥，E-mail：z en g lin x ian g@soh u.com；Tel：13037209570