骨髓間充質干細胞促進皮膚創口愈合及W n t信號通路在愈合過程中的作用

王志紅，黃漢，張斌，馬競，張佳

（1.遼寧醫學院 研究生學院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫學院附屬第一醫院 口腔科，遼寧 錦州 121001）

論著

骨髓間充質干細胞促進皮膚創口愈合及W n t信號通路在愈合過程中的作用

王志紅1，黃漢2，張斌2，馬競2，張佳1

（1.遼寧醫學院 研究生學院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫學院附屬第一醫院 口腔科，遼寧 錦州 121001）

目的研究骨髓間充質干細胞（B M S C s）對皮膚創口愈合及W n t信號通路在愈合過程中的作用。方法原代培養S p r a g u e D aw l y大鼠B M S C s并C D29、C D44、C D90、C D45細胞表面標志物鑒定；構建SD大鼠皮膚創口損傷模型；實驗分組：磷酸緩沖鹽溶液（P B S）對照組、B M S C s組，分別將P B S、B M S C細胞皮下注射到創口周圍，觀察創口愈合情況，計算創口愈合率；蛋白免疫印跡法檢測W n t1和β-c a t e nin基因表達水平。結果第3代B M S C s形態多為梭形、多突形。B M S C s可均一表達C D29、C D44、C D90，其陽性率分別為87.29%、91.66%和76.18%；而C D45呈陰性，其陽性率為3.14%。B M S C s可顯著促進大鼠創口愈合；B M S C s組大鼠創面愈合率均高于P B S組，差異有統計學意義。蛋白免疫印跡結果B M S C s促進W n t1和β-c a t e nin基因蛋白表達。結論B M S C s能促進創口愈合，其促進作用可能與W n t信號通路有關。

骨髓間充質干細胞；傷口愈合；信號通路

口腔頜面部外傷、腫瘤等常可造成大面積創傷缺損、瘢痕，嚴重者可致面部外形改變，由于位置特殊，常給患者造成巨大心理壓力。常規的皮膚、組織瓣等移植治療有許多條件限制，難以滿足目前臨床需要。骨髓間充質干細胞（bone marro w mesenchymal stem cells，B M S C s）屬于多潛能干細胞，具有多向分化潛能，在特定誘導條件下可分化成多種組織細胞，能夠作為理想的種子細胞用于組織器官損傷修復。

1　材料與方法

1.1動物與試劑

實驗所用S pra g u e Da w ly大鼠（以下簡稱S D大鼠）雄鼠由遼寧醫學院動物中心提供。達爾伯克必需基本（d u lbecco's minim u m essential medi u m，D M E M）低糖培養基購自美國H yclone公司，胎牛血清購自美國H yclone公司，W nt1、β-鏈蛋白（β-catenin）抗體購自上海萬類生物公司。

1.2SD大鼠BMSCs的原代培養

選取同一時期繁殖的4只200 g左右S D雄鼠，10%水合氯醛按0.3ml/100 g腹腔注射麻醉，75%酒精浸泡消毒，超凈臺內取雙側股骨，分離去除骨表面附著組織。剪開一側骨骺，暴露髓腔，用含20%胎牛血清的D M E M完全培養基自另一側骺端反復沖洗骨髓腔，將沖洗液收集到10 cm培養皿中，吹打混勻，置于37℃、5%二氧化碳C O2、飽和濕度的培養箱中培養。

3 d后首次更換培養基，每48 h更換培養基，直至細胞融合至90%，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3接種于新的培養皿，2～3 d更換培養基，選擇形態均一、生長狀態良好的繼續傳代，第3～5代培養的B M S C s用作實驗收集細胞。

1.3細胞鑒定

取第3代骨髓間充質干細胞，0.25%胰酶消化，離心收集細胞，加磷酸緩沖鹽溶液（phosphate b uff er saline，P B S）吹打成細胞懸液，調整密度為1×106/ml，加入到已標記抗體（C D29、C D44、C D90、C D45）的流式管中，37℃孵育30min，離心收集細胞，留沉淀，P B S漂洗3次，P B S重懸細胞，流式細胞儀檢測并分離含B M S C s陽性表面標志物的細胞繼續培養用于后續實驗。

1.4皮膚創口損傷模型制備及處理

S D雄鼠20只，隨機分成兩組。經10%水合氯醛麻醉后，背部剃毛，用無菌眼科剪在一側背部做直徑2 cm左右的全層皮膚損傷模型，將P B S、分離純化后的B M S C s分別皮下注射到兩組大鼠創口周圍，模型制備當天記為第1天，分別于1、7和14d觀察創口愈合情況，計算創面愈合率。創面愈合率（%）=（開始創傷面積-未愈合創面面積）/開始創傷面積。

1.5蛋白免疫印跡法

14 d麻醉處死實驗大鼠，沿創口周圍2mm處剪下創口皮膚全層，取下的組織經研磨、裂解，提取蛋白樣品。蛋白濃度測定后，樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉至聚偏二氟乙烯膜上。一抗4℃過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris b uff ered saline and t w een 20，T B S T）洗3次，二抗室溫1 h，化學發光法檢測蛋白表達。

1.6統計學方法

采用S P SS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，各組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1第3代大鼠骨髓間充質干細胞

B M S C s細胞形態多為梭形、多突形，其中混雜圓形的造血細胞。細胞培養5～7 d細胞融合可＞90%；傳代細胞24 h內基本貼壁，之后細胞單克隆復制多呈束狀或漩渦狀排列。見圖1。

2.2BMSCs表面標記物鑒定流式細胞儀的檢測

第 3代大鼠的 B M S C s可均一表達 C D29、C D44、C D90，其陽性率分別為87.29%、91.66%和76.18%；而C D45呈陰性，其陽性率為3.14%。

2.3大鼠創口愈合過程

圖1　第3代大鼠骨髓間充質干細胞 （×100）

3組實驗大鼠7和14 d時創口愈合情況比較，B M S C s組大鼠創口愈合明顯較P B S組快，B M S C s可顯著促進大鼠創口愈合（見圖2）。B M S C s組7和14 d大鼠創面愈合率分別為（86.464±1.278）%和（90.062±0.172）%均明顯高于P B S組的（41.972± 1.621）%和（61.664±2.477）%，經用單因素方差分析，差異有統計學意義（P=0.000）（見圖3）。

2.4蛋白免疫印跡法檢測

B M S C s組W nt1和β-catenin基因蛋白表達水平高于P B S組。見圖4。

圖2　大鼠創口愈合過程

圖3　大鼠創口愈合率

圖4　免疫印跡法檢測W n t1和β-c ate n i n蛋白表達水平

3　討論

皮膚創口愈合是一個涉及多種細胞、多種因子的修復、重建過程［1］，是各種組織再生和肉芽組織增生、瘢痕組織形成的復雜組合，表現出各種過程的協同作用。大致包括炎癥、增殖和重塑階段［2］。長期的皮膚創口愈合不良對患者生活、工作具有重大影響，是臨床研究的重點與熱點。近年來，隨著分子生物學的發展，人們對皮膚創面愈合機制的研究也逐漸深入。

B M S C s屬于多能干細胞，具有多向分化潛能、造血支持、免疫調控和自我復制等特點。在特定誘導條件下，體內或是體外培養的B M S C s可分化為骨、軟骨、內皮、心肌等多種組織細胞，能夠用于衰老病變組織器官的損傷修復。B M S C s在骨髓中的含量很少，約占有核細胞的0.001%～0.100%［3］，原代培養B M S C s通過換液去除大量未貼壁的造血細胞，呈圓形或類圓形的貼壁細胞傳代培養后形態多為梭形、多突形。本研究中，原代培養的B M S C s可大量擴增并傳代，且經鑒定第3代大鼠的B M S C s可均一表達C D29、C D44、C D90，其陽性率分別為87.29%、91.66% 和76.18%；而C D45呈陰性，其陽性率為3.14%。

B M S C s可顯著促進實驗大鼠創口愈合，且創面愈合率明顯高于對照組。B M S C s促進創口愈合的具體機制目前仍不完全清楚。其可能機制有：①B M S C s的自我更新能力和多向分化能力可長期保持，其可在創面局部增生并分化為創面修復所需的細胞，如角質形成細胞、毛囊細胞、皮脂腺細胞、汗腺細胞等［4-5］。②促進皮膚網狀嵴樣結構形成。③B M S C s的旁分泌作用。許多研究表明，B M S C s可分泌大量促進創面愈合的生長因子［6］。④免疫調理作用。⑤B M S C s可能還有促進體內干細胞遷移到傷口局部、減輕纖維化、保持細胞外基質內環境平衡及減少細胞凋亡等作用［7］。

大量實驗研究表明，W nt蛋白家族參與細胞增殖、凋亡、分化等多種生物學過程［8］，并參與維持干細胞的多潛能性等。W nt信號通路是一條高度保守的信號通路，由W nt蛋白及其受體、調節蛋白等組成。W nt信號通路主要有3條途徑：①經典W nt/β-catenin通路，又稱為經典W nt通路；②W nt/PCP通路，又稱平面細胞極性信號通路；③W nt/C a2+通路。其中，最被熟知的是經典W nt/β-catenin通路，而W ntl是激活經典W nt信號通路的主要W nt蛋白［9-10］。有研究證實，經典W nt信號通路中的相關成員參與創面愈合［11］，其參過程可能與其具有調控皮膚及其附屬器的發育、誘導皮膚附件的形態發生、促進創面血管新生及上皮重塑等多種功能有關。免疫印跡檢測結果表明，B M S C s能促進W nt1和β-catenin基因蛋白表達水平，激活經典W nt/β-catenin，促進創口愈合。

B M S C s能夠有效促進大鼠皮膚創傷愈合，為臨床治療提供實驗依據。但B M S C s實際應用到臨床仍有一些不足之處。自體和同種異體干細胞移植治療均已有致瘤報道，例如干細胞移植后致皮膚惡性腫瘤、胃癌、成骨肉瘤等［12］。并且B M S C s還可促進宿主體內原有腫瘤的生長［13］。另外，B M S C s體外移植后能否繼續保持未分化狀態、是否能起到長期的作用效果還需要進一步探索。因此，B M S C s治療創口愈合的臨床應用還有待進一步評估。

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（童穎丹 編輯）

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on skin wound healing and role of W nt signaling pathway in healing process

Zhi-hong Wang1，Han Huang2，Bin Zhang2，Jing Ma2，Jia Zhang1
（1.Graduate School of Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China；2.Department of Stomatology，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China）

Objective To study the effect of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）on skin wound healing and the role of Wnt signaling pathway in the healing process.M ethods Primary cultured BMSCs were from SD rats.CD29，CD44，CD90 and CD45 cell surface markers were identified.SD rat skin wound healing model was constructed.Experimental groups included PBS control group and BMSCs group，in which the PBS and BMSCs were injected subcutaneously around the wound respectively.Wound healing was observed and the rate of wound healing was calculated.Using Western blot Wnt1 andβ-catenin expression levels were detected. Results The third-generation BMSCs were fusiform and multi-shaped with protrusions.BMSCs could uniform ly express CD29，CD44 and CD90，the positive rates were 87.29%，91.66%and 76.18%respectively；the positive rate of CD45 was only 3.14%.BMSCs could significantly promote wound healing in the rats.The wound healing rate of the BMSCs group was significantly higher than that of the PBS group，and the BMSCs promoted Wnt1 andβ-catenin protein expressions.Conclusions BMSCs can promote wound healing，which may be related to the promotion of the role of Wnt signaling pathway.

bone marrow mesenchymal stem cell；wound healing；signal pathway

R 683

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.010

1005-8982（2016）15-0056-04

2015-12-18

黃漢，E-mail：k q2015525@163.com；Tel：0416-4197262