小鼠孕早期暴露量子點對妊娠結局和CD4+CD25+Tre g細胞的影響*

鄭鳳霞，許恒毅，傅芬

（1.南昌大學第二附屬醫院 婦產科，江西 南昌 330006；2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

論著

小鼠孕早期暴露量子點對妊娠結局和CD4+CD25+Tre g細胞的影響*

鄭鳳霞1，許恒毅2，傅芬1

（1.南昌大學第二附屬醫院 婦產科，江西 南昌 330006；2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

目的探討小鼠孕早期暴露硫化鋅量子點（Q Ds）對妊娠結局和外周血C D4+C D25+T r e g細胞的影響。方法制備成年健康孕鼠并將其隨機分為高劑量Q Ds組、低劑量Q Ds組和對照組，分別于妊娠第3～5天尾靜脈注射0.50和0.05μm ol/L Q Ds，以及生理鹽水各100μl，于妊娠第15天觀察妊娠結局，并采用流式細胞術分析孕鼠外周血C D4+C D25+T r e g細胞比例。結果Q Ds可引起流產、吸收胎和死胎等不良妊娠結局，高劑量Q Ds使胚胎平均著床數、胎鼠均重及胎盤均重低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且Q Ds暴露孕鼠外周血C D4+C D25+T r e g細胞的比例低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論小鼠孕早期暴露Q Ds具有胚胎毒性，且其毒性機制可能與降低外周血中C D4+C D25+T r e g細胞比例、擾亂妊娠免疫耐受有關。

量子點；生殖毒理；C D4+C D25+T r e g細胞；妊娠免疫耐受

近年隨著納米材料的規模化生產和納米產品的普及，人類主動或被動接觸納米材料的機會越來越多，但納米材料兼有材料本身引起的毒性和納米尺寸效應、表面效應等而致的特殊毒性，納米毒理學成為納米技術可持續發展的關鍵環節，也是現代毒理學的前沿領域。生殖毒理學是一個關乎人類繁衍健康和社會發展的多領域交叉學科，研究納米材料的生殖毒理具有重要意義。量子點（q u ant u m dots，Q Ds）作為新型無機熒光納米粒子具有熒光壽命長、耐光漂白、發射光譜窄而對稱、激發光譜寬而連續等優點，在生物醫學領域如生物分子檢測、生物熒光標記、活體成像、熒光定位和動態示蹤等表現出巨大的應用潛力［1-2］。相對于量子點細胞毒性和一般活體毒性的研究而言，關于量子點生殖毒性及用于篩選和評價生殖損傷觀察指標的研究報道較少［3-4］。妊娠是一個復雜而又協調的過程，母胎界面正常免疫耐受的建立和維持是妊娠成功的關鍵。C D4+C D25+Tre g細胞起源于胸腺，可以抑制同種異體移植物的排斥反應，在妊娠免疫耐受中的作用備受關注。大量研究表明，其不但參與母胎免疫耐受機制的形成，而且對其維持發揮積極作用，C D4+C D25+Tre g細胞平衡的失調可影響妊娠的結局［5-6］。本文以量子點為研究材料，以成年健康孕鼠為評價模型，研究評估小鼠孕早期暴露量子點引發的生殖毒性，并從C D4+C D25+Tre g細胞比例變化的角度探究其毒性機制，為認識量子點的生殖安全提供重要的實驗參考。

1　材料與方法

1.1實驗動物

選擇健康出生7周齡的S P F級昆明雌性小鼠24只，雄性12只，體重28～30 g，由南昌大學動物科學部提供，動物合格證號為S Y X K（贛）2015-0002。本實驗經實驗動物研究倫理委員會批準，批準號為0064257。實驗動物在南昌大學動物房內飼養，室溫保持22～24℃，相對濕度為55%～60%，晝夜交替各12 h，自由攝食、飲水，定期更換墊料。

1.2主要試劑與儀器

硫化鋅量子點原液（濃度為10μmol/L，水化粒徑為8～10 nm，吸收光譜為400～600 nm，發射光譜為540～560 nm）購自美國O cean NanoTech公司，A nti-M o u se C D4-異硫氰酸熒光素（f l u orescein isothiocyanate，F I T C）單抗、A nti-M o u se C D25-藻紅蛋白（P hycoerythrin，P E）單抗、A nti-M o u se I g G2a抗體購自美國B D公司。流式細胞儀購自美國B D公司，超凈生物工作臺購自蘇州凈化設備有限公司，電子天平購自上海梅特勒-托利多有限公司，恒溫水浴箱購自江蘇金壇市中大公司，離心機購自安徽中科中佳科學儀器公司。

1.3實驗動物分組及染毒

將所購小鼠適應性飼養1周后，于下午5∶00將雌性、雄性小鼠以2∶1比例合籠，次日清晨8∶00檢查陰栓，以查見陰栓日為妊娠第1天，其余妊娠天數依次類推。參照文獻［7-8］的量子點染毒劑量，將所得24只妊娠早期雌鼠完全隨機化分為3組，分別為對照組（生理鹽水）、低劑量（0.05μmol/L）和高劑量（0.50μmol/L）Q Ds組，每組8只，于妊娠第3、4和5天采用尾靜脈注射方式染毒，染毒容量為100μl/只，1次/d，連續染毒3 d。實驗期間，每天上午9∶00稱量記錄孕鼠體重，并觀察記錄其呼吸、神態、活動和陰道出血等情況。

1.4孕鼠的解剖和胚胎毒性的觀察

將所有孕鼠于妊娠第15天摘除眼球，收集新鮮抗凝血后頸椎脫臼處死，迅速沿腹中線剖開腹腔暴露子宮。首先觀察記錄死胎、活胎和吸收胎，然后剪除子宮，去掉血污后依次分離胎盤、胎鼠，稱量胎鼠、胎盤的重量。

1.5流式細胞術檢測孕鼠外周血CD4+CD25+Tre g細胞的比例

取新鮮抗凝血100μl，加入A nti-M o u se C D4-F I T C單抗10μl、A nti-M o u se C D25-P E單抗10μl（同時設置A nti-M o u se I g G2a同型陰性對照反應管、A nti-M o u se C D4-F I T C單陽管和 A nti-M o u se C D25-P E單陽管）輕微混勻，室溫避光孵育25min，加入紅細胞裂解液2ml，避光裂解10min，1 200 r/min離心5min，棄上清液，加入1 ml磷酸鹽緩沖溶液（phosphate b uff er saline，P B S）洗滌細胞，1 200 r/min離心5min后棄上清液。再加入500μl P B S重懸細胞，30min內在流式細胞儀上機檢測，根據前向角散射（f or w ard scatter，F S C）和側向角散射（side scatter，SS C）光信號圈定淋巴細胞群，根據同型陰性對照樣品（小鼠I g G2a同型對照反應管）來調整儀器電壓，用C D4單陽和C D25單陽樣品來調整F I T C和P E之間的熒光補償，以淋巴細胞群設門來計算C D4+淋巴細胞的比例，以C D4+設門來計算C D4+C D25+Tre g細胞占C D4+T細胞比例。

1.6統計學方法

采用S P SS 19.0統計軟件分析處理實驗數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間數據比較用t檢驗，多組間數據比較用單因素方差分析（O ne-w ay，A N OV A）及LS D檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1一般觀察結果

觀察期間各組孕鼠均未出現死亡現象，高劑量Q Ds組孕鼠進食、進水量較對照組和低劑量Q Ds組明顯減少，其毛色晦暗，嗜睡，活動減少，精神萎靡，其中有3只孕鼠出現陰道流血、體重驟降等癥狀；低劑量Q Ds組孕鼠注射藥物后出現易激惹、躁動不安等癥狀；對照組所有孕鼠未發現異常。觀察期間高劑量Q Ds組、低劑量Q Ds組孕鼠體重凈增長率［孕期體重凈增長率=（妊娠當日體重-妊娠第1天體重）/妊娠第1天體重×100%］較對照組減少。見附圖。

2.2量子點對妊娠結局的影響

本研究觀察期間高劑量Q Ds組有3只孕鼠發生流產，解剖其余5只孕鼠見3只死亡胚胎及4個吸收胎等不良妊娠結局，各組胚胎平均著床數比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=8.927，P=0.002）。各組胎鼠均重比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=87.824，P=0.000）。各組胎盤均重比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=21.640，P=0.000）。量子點暴露孕鼠平均著床數、胎鼠均重和胎盤均重低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3Q Ds對CD4+CD25+Tre g細胞的影響

附圖　量子點對孕鼠凈體重變化的影響

高劑量Q Ds組、低劑量Q Ds組孕鼠外周血中C D4+T細胞的比例比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=73.199，P=0.000）。C D4+C D25+Tre g細胞占C D4+T細胞比例比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=210.998，P=0.000）。Q Ds暴露孕鼠外周血中C D4+T細胞的比例及C D4+C D25+Tre g細胞占C D4+T細胞比例低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1　孕鼠妊娠早期暴露量子點對妊娠結局的影響（n=8，）

表1　孕鼠妊娠早期暴露量子點對妊娠結局的影響（n=8，）

注：t1、P1值：低劑量Q Ds組與對照組比較；t2、P2值：高劑量Q Ds組與對照組比較

組別胎盤均重/ g對照組　1 5 . 1 3 ± 2 . 6 4 　0 . 3 3 ± 0 . 2 5 　0 . 1 4 ± 0 . 0 1低劑量Q D s組　1 2 . 6 7 ± 1 . 8 6 　0 . 2 9 ± 0 . 0 1 　0 . 1 2 ± 0 . 1 0高劑量Q D s組　9 . 0 0 ± 3 . 2 4 　0 . 2 3 ± 0 . 1 3 　0 . 1 0 ± 0 . 0 1 t1值　3 . 5 2 7 　-1 8 . 2 0 5 　-4 . 1 2 3 P1值　0 . 0 1 0 　0 . 0 0 0 　0 . 0 0 4 t2值　-4 . 2 3 0 　1 2 . 8 0 2 　-1 2 . 6 9 4 P2值　0 . 0 1 3 　0 . 0 0 0 　0 . 0 0 0平均著床數/個胎鼠均重/ g

表2　孕鼠妊娠早期Q Ds對外周血CD4+CD25+Tre g細胞的影響 （n=8，%）

表2　孕鼠妊娠早期Q Ds對外周血CD4+CD25+Tre g細胞的影響 （n=8，%）

注：t1、P1值：低劑量Q Ds組與對照組比較；t2、P2值：高劑量Q Ds組與對照組比較

組別C D 4+C D 2 5+/ C D 4+對照組　3 1 . 9 0 ± 2 . 7 5 　3 7 . 1 3 ± 2 . 6 0低劑量Q D s組　2 6 . 8 8 ± 1 . 9 1 　2 3 . 7 0 ± 1 . 0 7高劑量Q D s組　1 8 . 5 7 ± 0 . 6 1 　1 9 . 9 0 ± 0 . 8 7 t1值　-8 . 2 3 0 　-2 9 . 3 2 7 P1值　0 . 0 1 7 　0 . 0 2 5 t2值　-5 6 . 0 8 7 　-5 1 . 0 9 5 P2值　0 . 0 0 0 　0 . 0 1 1 C D 4+

3　討論

納米材料的生殖毒性研究主要包括對生殖能力、宮內胚胎發育和子代的影響等方面。2008年C H A N等［9］發現，Q Ds具有小鼠囊胚發育毒性，可誘導囊胚凋亡，經Q Ds染毒后的囊胚種植到子宮內膜后，其發育較對照組緩慢。H S I E H等［10］通過體外實驗研究發現Q Ds有較明顯的胚胎發育毒性，經Q Ds干預后發育的胚胎著床后吸收胎率增加，胎盤及胎兒重量明顯減輕。但目前關于妊娠早期Q Ds的生殖毒性及其機制的動物體內實驗較少見，且妊娠早期是哺乳動物最為敏感的時期，妊娠母體在該階段接觸藥物或化學材料更易對子代造成不同程度的影響，研究納米材料的胚胎毒性對環境保護和健康有重要意義。本實驗在小鼠妊娠的第3～5天經尾靜脈注射Q Ds，結果發現Q Ds暴露孕鼠的平均胎仔數、胎鼠均重和胎盤均重等較對照組減少，且高劑量Q Ds組孕鼠出現流產、死胎及吸收胎等不良妊娠結局，表明小鼠孕早期以靜脈注射方式暴露一定量的Q Ds可導致胚泡著床障礙和胚胎宮內發育遲緩等毒性。

納米材料本身及其釋放的重金屬離子毒性可與其干擾性激素水平、調節機體免疫和相關氧化應激水平等因素相關［11-12］。從生殖免疫學觀點來看，胚胎擁有一半父源性遺傳物質，一次成功的妊娠形同一次成功的同種異體移植，胚胎所攜帶的父源性抗原刺激母體免疫活性細胞進行免疫應答，但同時母體內具有免疫抑制功能的細胞也增加，使免疫應答和免疫抑制相平衡，才能使胎兒正常發育直至分娩，母胎界面正常免疫耐受的建立和維持是妊娠成功的關鍵。C D4+C D25+Tre g細胞是一群具有免疫調節功能的細胞群，是機體調控不適當或者過強免疫應答的關鍵機制之一，其通過調控抑制性T細胞，抑制自身反應性T細胞，亦能促進一些抑制性細胞因子（如轉化生長因子和白細胞介素-10）的分泌等，在防止自身免疫性疾病及母胎免疫耐受機制的形成和維持中發揮重要作用［5-6］。研究表明，正常妊娠時孕體外周血中C D4+C D25+Tre g細胞比例升高，而不明原因復發性流產者或其他病理妊娠機體外周血中C D4+C D25+Tre g細胞比例較正常妊娠者減少［13-14］。R OW E等［15］報道在易發流產的機體外周血中C D4+C D25+Tre g細胞數量較正常妊娠組明顯減少，C D4+C D25+Tre g細胞缺乏可導致母體產生針對胎兒的免疫排斥，使流產率增加。本實驗中通過流式細胞術檢測不同處理組孕鼠外周血C D4+C D25+Tre g細胞，結果發現，Q Ds暴露孕鼠外周血中C D4+C D25+Tre g細胞比例較對照組降低，且高劑量Q Ds組最低，差異有統計學意義（P＜0.05）。推測孕鼠妊娠早期暴露于Q Ds引發的胚泡著床障礙、胚胎宮內發育遲緩等胚胎毒性，可能與其降低C D4+C D25+Tre g細胞比例破壞母胎免疫耐受平衡有關，但關于新型納米材料量子點的生殖毒性的具體機制及其有關因素有待進一步研究。

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（童穎丹 編輯）

Effects of quantum dots on pregnancy outcomes and CD4+CD25+regulatory T cells in early pregnant m ice*

Feng-xia Zheng1，Heng-yi Xu2，Fen Fu1
（1.Department of Gynecology，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China；2.National Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330047，China）

Objective To investigate the effects of quantum dots（QDs）on pregnancy outcomes and CD4+CD25+regulatory T cells in early pregnant mice.M ethods The pregnant mice were randomly divided into three groups（QDs high-dose exposure group treated with 0.5μmol/L QDs，100μl/mice per day；low-dose exposure group treated with 0.05μmol/L QDs，100 ul/mice per day；and normal saline group treated with 0.9% NS，100μl/mice per day）.Solutions of the different treatment materials were administered by tail vein injection on the 3rd-5th GD.The pregnant outcomes were observed and CD4+CD25+regulatory T cells in the peripheral blood were detected by flow cytometry on the 15th GD.Results In the QDs exposure groups，the pregnant mice showed abnormal pregnancy outcomes（abortion，stillbirth and fetal absorption）.The avrage number of embryo implantation，offspring's body weight and placental weight in the high-dose exposure group were significantly lower than those of the control group（P＜0.05）.The proportion of CD4+CD25+regulatory T cells in CD4+T cells in the QDs groups was significantly lower than that of the control group（P＜0.05）. Conclusions The exposure of pregnant mice to QDs during early pregnancy is harm ful to embryos.One of the toxicity mechanisms may be related to the decrease of CD4+CD25+regulatory T cells in the peripheral blood.

quantum dot；reproductive toxicology；CD4+CD25+regulatory T cell；pregnancy immune tolerance

R 994

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.005

1005-8982（2016）15-0028-04

2015-12-25

江西省青年科學基金（No：20143A C B21003）

傅芬，E-mail：fu_f en@163.com