維生素C含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的改革

趙玉紅， 李　欣， 崔建林， 周　浩， 李登文， 張金紅， 趙立青

(1. 南開大學(xué) 生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 天津　300071； 2. 南開大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 天津　300071)

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維生素C含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的改革

趙玉紅1， 李欣1， 崔建林2， 周浩1， 李登文1， 張金紅1， 趙立青1

(1. 南開大學(xué) 生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 天津300071； 2. 南開大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 天津300071)

為培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)系統(tǒng)的思維方式、提高數(shù)據(jù)分析能力,對(duì)本科生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中“維生素C的含量檢測(cè)”實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改革與創(chuàng)新。在保留傳統(tǒng)的2,6-D滴定法基礎(chǔ)上,新增了高效液相色譜分析方法的部分內(nèi)容。采用C18色譜柱,流動(dòng)相為0.1%草酸,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為255 nm,外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示:維生素C(Vc)在5～100 μg/L內(nèi)有良好的線性關(guān)系(R2=0.999 5),每100 g獼猴桃中Vc含量為95.47 mg。通過對(duì)同一實(shí)驗(yàn)多角度開展研究,使學(xué)生深入掌握生物化學(xué)研究中常用的定性與定量方法,培養(yǎng)學(xué)生對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)與分析能力。

維生素C; 含量檢測(cè)； 高效液相色譜

維生素C(Vc)又稱抗壞血酸,是維持機(jī)體正常生命活動(dòng)所必需的小分子有機(jī)化合物。人體自身不能合成Vc,必須從食物、藥物中攝取,因此食品、藥物中Vc的分析與測(cè)定具有重要意義[1]。Vc含量的檢測(cè)方法有很多,傳統(tǒng)的有2,6-二氯酚靛酚(簡(jiǎn)稱2,6-D)滴定法[2-3]、比色法[4-5]、熒光法[6-7]等。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,近年來,已有不少文獻(xiàn)報(bào)道利用高效液相色譜法(簡(jiǎn)稱HPLC)測(cè)定Vc的含量[8-12]?！熬S生素C的含量檢測(cè)”是目前高等院校生化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中普遍開設(shè)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,常以水果、蔬菜為原材料,采用2,6-D滴定法。

學(xué)生在進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)中,不僅要接觸到各種實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,而且獲得了大量的數(shù)據(jù),因此培養(yǎng)學(xué)生對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)與分析,成為生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)中不可或缺的環(huán)節(jié)[13]。為了加強(qiáng)學(xué)生的數(shù)據(jù)分析能力,培養(yǎng)科學(xué)系統(tǒng)的思維方式,結(jié)合現(xiàn)有的“維生素C的含量檢測(cè)”實(shí)驗(yàn)特點(diǎn),在保留傳統(tǒng)的2,6-D滴定法基礎(chǔ)上,利用中心儀器平臺(tái)的2臺(tái)高效液相色譜儀,并新增了HPLC這一科研與實(shí)際生產(chǎn)中廣泛使用的定性與定量分析方法。

1　主要儀器、試劑與材料

儀器:CoM高效液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器),電子天平等。

試劑與材料:Vc標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自天津市化學(xué)試劑研究所(分析純),草酸購(gòu)自天津市化學(xué)試劑供銷公司(分析純),ddH2O，獼猴桃樣品為市售。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1樣品前處理

根據(jù)參考書《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)習(xí)題集》[14],稱取2.0 g獼猴桃,加入3～5 mL、1%草酸研成漿狀后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,定容,混勻后,濾紙過濾。濾液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,供HPLC分析用。

2.2Vc標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精確稱取0.01 g Vc標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 mL容量瓶中,加10 mL、0.1%草酸溶解,制得質(zhì)量濃度為1 g/L的Vc標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取一定量的Vc標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用1%的草酸溶液稀釋制得質(zhì)量濃度分別為100、80、50、25、5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液,0.45 μm濾膜過濾,備用。Vc標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.3色譜條件

色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相為0.1%草酸，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為255 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

3　結(jié)果與分析

3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品色譜圖

分別取Vc標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品液按2.3節(jié)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得的色譜圖分別見圖1和圖2。結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)溶液中Vc保留時(shí)間t為7.418 min,獼猴桃樣品中Vc保留時(shí)間為7.427 min,保留時(shí)間基本一致,分離效果好且峰形對(duì)稱,可用于定量檢測(cè)。由于水果中色素等雜質(zhì)的影響,在獼猴桃中Vc峰之后還有3個(gè)小的雜質(zhì)峰,保留時(shí)間依次為11.303 min,18.015 min,28.352 min。

圖1　Vc標(biāo)準(zhǔn)工作液的HPLC色譜圖

圖2　獼猴桃樣品中Vc的HPLC色譜圖

3.2方法的線性范圍

將2.2節(jié)制備的Vc標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣,記錄色譜圖及峰面積響應(yīng)值,以Vc濃度c(Vc)為橫坐標(biāo),相對(duì)峰面積S為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,如圖3所示?；貧w方程為y=19 345x+16 835,R2=0.999 5,結(jié)果表明Vc在5～100 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3　維生素C的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3獼猴桃中Vc的含量測(cè)定

取經(jīng)2.1節(jié)方法處理過的獼猴桃樣品濾液,進(jìn)樣,記錄色譜圖。經(jīng)計(jì)算,每100g獼猴桃中Vc含量為95.47mg。

4　討論

4.1選材及樣品前處理

HPLC法所采用的實(shí)驗(yàn)材料及樣品前處理方式與傳統(tǒng)的2,6-D滴定法完全一致,即稱取一定量的獼猴桃加入1%草酸研磨,定容,過濾。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[15]表明,Vc在酸性溶液中6 h內(nèi)較為穩(wěn)定,無顯著變化,可用于定量分析。因此學(xué)生可在2,6-D滴定法檢測(cè)完后,直接取少量樣品濾液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,即可進(jìn)行HPLC檢測(cè)。這樣的選材及樣品前處理方式具有以下優(yōu)點(diǎn):

(1) 簡(jiǎn)便、易行,因獼猴桃自身色素條件,不需要進(jìn)行脫色處理,即可進(jìn)行2,6-D滴定法和HPLC檢測(cè),Vc損失少且不需要學(xué)生重復(fù)處理樣品；

(2) 可在有限的課時(shí)資源里擴(kuò)大課程的知識(shí)量,經(jīng)典與前沿分析方法相結(jié)合,多角度拓展學(xué)生思維；

(3) 利于學(xué)生對(duì)同一樣品、不同檢測(cè)方法得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較、分析。

4.2課程設(shè)計(jì)

基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課都有一定的課時(shí)限制,課程組通過大量的預(yù)實(shí)驗(yàn),對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了最佳的檢測(cè)方案，并通過方法學(xué)考察驗(yàn)證了該方案的可靠性。實(shí)驗(yàn)課上學(xué)生只做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線以及樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn),教師先將2臺(tái)HPLC儀器調(diào)試好,將Vc標(biāo)準(zhǔn)品課前準(zhǔn)備好,由實(shí)驗(yàn)完成速度快的幾名學(xué)生來完成標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè),每臺(tái)儀器出一組標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)。其他學(xué)生完成2,6-D滴定法檢測(cè)后,直接拿自己的樣品進(jìn)樣即可。根據(jù)圖2樣品的色譜圖結(jié)果,每個(gè)學(xué)生進(jìn)樣時(shí)間控制在11 min左右,在排除雜質(zhì)干擾、不影響峰面積響應(yīng)值的情況下,盡量縮短Vc檢測(cè)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)的間隙,為學(xué)生普及HPLC的工作原理、應(yīng)用、注意事項(xiàng)、樣品前處理以及方法學(xué)中相關(guān)概念等知識(shí)。

4.3數(shù)據(jù)分析

在“維生素C的含量檢測(cè)”實(shí)驗(yàn)教學(xué)中,需要對(duì)大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

(1) 傳統(tǒng)的2,6-D滴定法。每個(gè)樣本設(shè)定了3個(gè)平行重復(fù),學(xué)生可以通過求平均值、方差和標(biāo)準(zhǔn)差,分析實(shí)驗(yàn)誤差的大小。

(2) 高效液相色譜法。學(xué)生通過Excel等軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立線性回歸。由于課時(shí)限制,方法學(xué)中的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率等實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)課上沒有時(shí)間進(jìn)行,缺少這部分?jǐn)?shù)據(jù)。鑒于HPLC實(shí)驗(yàn)的完整性、系統(tǒng)性,方法學(xué)實(shí)驗(yàn)不可或缺,為彌補(bǔ)這部分缺憾,通常教師將預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)所得的相關(guān)峰面積數(shù)值告訴學(xué)生,學(xué)生帶著已知數(shù)據(jù)課后進(jìn)行方法學(xué)分析。

4.4課后思考題

為使學(xué)生充分內(nèi)化吸收兩種分析方法的原理與研究思路,課后布置思考題,思考結(jié)果在實(shí)驗(yàn)報(bào)告里得以體現(xiàn)。如:

(1) 為準(zhǔn)確測(cè)得Vc的含量,實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意哪些操作步驟？

(2) 如何選擇樣品的不確定度才能使測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性接近真實(shí)？

(3) 需要獲得哪些有用的數(shù)據(jù)信息用以支撐所測(cè)得結(jié)果的科學(xué)有效等？

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的授課對(duì)象為大二年級(jí)的本科生,他們?cè)诖笠荒昙?jí)都學(xué)過分析化學(xué),有一定的基礎(chǔ)。對(duì)通過實(shí)例獲得的大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、歸納、總結(jié),由繁入簡(jiǎn),由簡(jiǎn)入繁,利于學(xué)生形成科學(xué)系統(tǒng)的思維方式,為今后從事科研工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

5　結(jié)語

通過色譜條件的優(yōu)化和合理的課程設(shè)計(jì),將HPLC這一先進(jìn)的分析技術(shù)與經(jīng)典檢測(cè)方法在同一實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中同時(shí)呈現(xiàn),使學(xué)生綜合掌握生物化學(xué)研究中常用的定性和定量方法。目前很多高校配備了高效液相色譜儀,且大多在生化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課中開設(shè)了“維生素C的含量檢測(cè)”實(shí)驗(yàn),改革后的實(shí)驗(yàn)需要學(xué)生課后對(duì)所得到的大量數(shù)據(jù)做出合理的統(tǒng)計(jì)與分析,以得出科學(xué)可靠的結(jié)論,這對(duì)于提高學(xué)生的數(shù)據(jù)分析能力,培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)系統(tǒng)的思維方式方面有著積極意義,值得推廣。

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Reform of experiment about content determination of Vitamin C

Zhao Yuhong1, Li Xin1, Cui Jianlin2, Zhou Hao1, Li Dengwen1, Zhang Jinhong1, Zhao Liqing1

(1. Biological Experimental Center,Nankai University,Tianjin 300071,China;2. College of Medicine,Nankai University,Tianjin 300071,China)

In order to cultivate the students’ mode of thinking and improve the data analysis ability,the experiment about determination of Vitamin C has been reformed in the teaching of biochemistry experiment. High performance liquid chromatography method was added while 2,6-D titration method was retained . The separation was conducted on C18 column with 0.1% oxalic acid as mobile phase.The flow rate was 1.0ml/min.The sample size was 20 μL. The detection wavelength was 255nm. The external standard method was used. The results show that vitamin C haS a good linear relationship (R2=0.999 5) in 5—100 μg/L,and the content of Vc was 95.47 mg/100 g. Through the study on the same experiment, the students have mastered the qualitative and quantitative research methods commonly used in biochemistry, and improved the ability of reasonable statistics and analysis on the data.

Vitamin C； content determination; high performance liquid chromatography

DOI:10.16791/j.cnki.sjg.2016.06.017

2015-12-15修改日期:2016-01-26

國(guó)家基礎(chǔ)學(xué)科人才培養(yǎng)基金“條件建設(shè)項(xiàng)目”(J1310003)；南開大學(xué)2014年教學(xué)改革項(xiàng)目

趙玉紅(1981—)，女，山東青島，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作

E-mail:zyh@mail.nankai.edu.cn

趙立青(1962—)，女，云南洱源，博士，教授，從事蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究以及基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的工程應(yīng)用.

E-mail:lqzhao@nankai.edu.cn

Q5-33

B

1002-4956(2016)6-0063-03