甘氨酸濃度對普通白菜幼苗生長及氮代謝關鍵酶活性的影響

王小麗周 倩黃丹楓*

（1上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234；2上海交通大學農業與生物學院，上海 200240）

甘氨酸濃度對普通白菜幼苗生長及氮代謝關鍵酶活性的影響

王小麗1，2周 倩2黃丹楓2*

（1上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234；2上海交通大學農業與生物學院，上海 200240）

為了探討不同濃度甘氨酸態氮對普通白菜幼苗生長和氮代謝的影響，在水培條件下比較了2個普通白菜品種（華王和五月慢）4個甘氨酸（Gly）濃度水平下（0、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol·L-1）全株干質量、總氮含量、總碳含量及氮代謝關鍵酶活性的差異。結果表明，2個普通白菜品種幼苗干質量、總氮含量、總碳含量及氮代謝關鍵酶活性均隨著甘氨酸濃度的增加呈先上升后降低的趨勢；2.5～10.0 mmol·L-1處理下2個普通白菜品種幼苗干質量、總氮含量、總碳含量、谷氨酰胺合成酶活性、谷氨酸合成酶活性及根系硝酸還原酶活性、根系谷草轉氨酶活性、根系谷丙轉氨酶活性大多顯著高于對照；20.0 mmol·L-1處理下2個普通白菜品種幼苗干質量、總碳含量、總氮含量及大部分酶活性基本與對照差異不顯著，其中五月慢幼苗干質量、地上部總氮含量、地上部和根系總氮含量顯著低于對照。綜上，適宜濃度的甘氨酸態氮處理下植株較高的GS、GOGA活性及根系NR、GOT、GPT活性有利于普通白菜對甘氨酸的同化利用，從而促進普通白菜的生長和碳氮積累。

普通白菜；甘氨酸濃度；硝酸還原酶；轉氨酶；谷氨酰胺合成酶；谷氨酸合成酶

植物能夠直接吸收利用無機氮，還能夠直接吸收利用氨基酸等有機氮。隨著對食品安全和生態環境的關注，以及有機農業的發展，施入到土壤及各種栽培基質中的有機物料越來越多，可溶性有機態氮在農業土壤氮素供應中的作用也越來越值得重視（Wang et al.，2015）。氨基酸不僅可以作為直接氮素來源維持植物的生長，而且在與無機氮配施的情況下還能顯著提高植物的抗逆能力，改善作物品質。Paungfoo-Lonhienne等（2008）認為，無機氮和蛋白質混施能明顯促進擬南芥生長，效果優于單獨施用無機氮或蛋白質。有機氮含量的提高，有助于煙葉內質、均價、上等煙比例的增加，單純施用無機氮或單純施用有機氮都會限制煙葉產量、質量的提高（李德強 等，2006）。甘氨酸、谷氨酰胺等均可作為普通白菜生長的優質氮素來源（王小麗等，2012），且氨基酸部分替代硝態氮能夠顯著降低普通白菜中硝酸鹽的積累（王華靜 等，2004）。因此，有必要開展植物有機氮營養研究，為開發有機肥料、促進有機廢棄物的合理利用及有機生態栽培提供理論支持。

氨基酸被植物吸收后的生理效應反應取決于作物種類、氨基酸種類、氨基酸濃度、氮源配比等。無菌水培條件下，等氮量（10 mg·L-1）有機氮、無機氮對小麥的營養效果依次為甘氨酸（Gly）＞谷氨酸（Glu）＞銨態氮（莫良玉 等，2002）。谷氨酰胺（Gln）處理下普通白菜幼苗地上部和根的干、鮮質量均隨營養液中Gln濃度的增加而增加，在5 mmol·L-1時達到最大（王華靜，2006）。0～6.0 mmol·L-1甘氨酸（Gly）濃度梯度范圍內，番茄植株的干物質量、總氮量、可溶性糖含量、地上部和根系中游離氨基酸、可溶性蛋白含量均隨營養液中Gly濃度的增加而增加，Gly濃度與番茄植株干物質量、總氮量呈顯著正相關（葛體達 等，2009）。生理生化、蛋白質組學、代謝組學等研究結果發現氨基酸態氮的營養效應與多種生理過程如光合作用、能量代謝及氮素同化相關（楊丹妮 等，2013；Wang et al.，2014a，2014b），其中GS-GOGAT循環及轉氨基作用可能是被吸收后的氨基酸在植物體內同化代謝的主要途徑（Thornton et al.，2007），但是具體的代謝機理仍缺乏深入研究及驗證。

甘氨酸是菜田土壤中含量最豐富的游離氨基酸之一（Kielland，1995；Wang et al.，2013），同時也是分子量最小、結構最簡單的氨基酸，不易被微生物吸收利用（Lipson et al.，1999），是植物有機氮研究的理想模式氮源。為了深入探討氨基酸濃度對植物生長及生理響應的影響，本試驗比較了兩個甘氨酸利用能力不同的普通白菜品種在不同甘氨酸濃度下生長、氮代謝關鍵酶活性等生理生化指標，以期從氮同化能力角度揭示植物有機氮吸收同化規律。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2013年在上海交通大學農業與生物學院人工氣候室內進行。供試普通白菜〔Brassica campestirs L.spp.chinensis（L.）Makino var.communis Tsen et Lee〕品種為華王（上海瑞奇種業有限公司）和五月慢（上海長征蔬菜種子公司）。分別選擇顆粒飽滿、均勻的完整種子，用70%酒精進行表面消毒，然后播于以珍珠巖為基質的128孔穴盤中，蒸餾水培養。待幼苗長至兩葉一心期時，用蒸餾水洗凈根部，移栽至10 L水培箱中，預培養3 d，營養液配方為1/2 Hoagland-Amon。

1.2 試驗設計

預培養3 d后洗凈根系，將長勢一致的幼苗轉移至相同容器的處理液中。試驗設4個不同水平的甘氨酸（Gly）濃度：0、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol·L-1，分別記為CK、2.5Gly、5.0Gly、10.0Gly 及20.0Gly。Fe以Fe-EDTA配入，其他營養元素按照1/2 Hoagland-Amon配方施入。在以上各溶液中均加入10 mg·L-1氨芐青霉素（優級純），抑制微生物活性（Okamoto & Okada，2004）。

為了驗證氨芐青霉素對微生物的抑制作用，設置同上4個濃度梯度的甘氨酸溶液（無植株），在相同條件下進行培養。48 h后Gly的降解率在0.20%～4.41%之間，認為可以忽略不計。

24 h持續通氣水培，每天用NaOH或H3PO4調節營養液pH值，使其范圍在5.8～6.2之間；每2 d更換1次添加氨芐青霉素的新鮮營養液，每處理20株，3次重復。

1.3 項目測定

培養10 d后，每處理分別取長勢一致的植株15株，先用自來水沖洗植株，再用蒸餾水沖洗，以去除表面殘留氮。一半材料留作鮮樣，用于酶活性測定；另一半材料經105 ℃殺青1 h，再在80℃下烘干至恒重，測定全株干質量、總氮及總碳含量。總碳、總氮含量采用Vario ELⅢ元素分析儀（德國Elementar）測定。谷草轉氨酶（GOT）、谷丙轉氨酶（GPT）活性參考吳良歡等（1998）的方法進行測定，轉氨酶活性以每克植物鮮樣單位時間內反應生成的丙酮酸含量來表示，單位為μmol·g-1·h-1（FW）。采用經過預冷的提取液〔10 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.6），1 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1β-巰基乙醇〕于冰浴中提取谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）粗酶液，谷氨酰胺合成酶活性參考郝再彬等（2004）的方法進行測定，以單位鮮質量在單位時間內催化形成的產物在540 nm處的吸光值大小表示，單位為A540·g-1·h-1（FW）；谷氨酸合成酶活性參考王小純等（2008）的方法進行測定，以每分鐘反應混合液減少1 μmol NADH為一個酶活性單位，單位為μmol·g-1·min-1（FW）。硝酸還原酶（NR）活性參考李合生（2000）的方法進行測定，以每克植物鮮樣每小時催化生成的亞硝態氮含量為一個酶活力，單位為μg·g-1·h-1（FW）。

1.4 數據處理

試驗數據采用SPSS 13.0統計軟件進行方差分析，采用LSD法檢測差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗干物質量的影響

隨著營養液中甘氨酸濃度的增加，兩個普通白菜品種的幼苗干質量均呈現先增加后降低的趨勢（表1）。與對照相比，2.5、5.0、10.0 mmol·L-1處理的華王幼苗干質量顯著增加了24.0%、45.1% 和37.0%，5.0 mmol·L-1和10.0 mmol·L-1處理間差異不顯著，20.0 mmol·L-1處理的華王幼苗干質量較對照降低了7.8%；2.5、5.0 mmol·L-1處理的五月慢幼苗干質量較對照顯著增加了21.1%和36.1%，而20.0 mmol·L-1處理顯著降低了五月慢幼苗干質量；不同濃度甘氨酸處理下，華王幼苗干質量均顯著高于五月慢。

2.2 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗總碳含量及總氮含量的影響

如表1所示，與對照相比，2.5、5.0 mmol·L-1處理顯著提高了華王、五月慢幼苗地上部總氮含量，分別增加了22.0%、24.4%和65.0%、90.0%；10.0 mmol·L-1處理僅顯著提高了華王幼苗地上部總氮含量，對五月慢影響不顯著；20.0 mmol·L-1處理對華王幼苗地上部總氮含量的影響不大，但顯著降低了五月慢幼苗地上部總氮含量。2.5、5.0、10.0、20.0 mmol·L-1處理的華王幼苗根系總氮含量比對照顯著增加了100.0%、155.6%、88.9% 和66.7%；2.5、5.0、10.0 mmol·L-1處理的五月慢幼苗根系總氮含量比對照顯著增加了433.3%、500.0%和266.7%，20.0 mmol·L-1處 理的 五 月慢幼苗根系總氮含量與對照差異不顯著；除2.5 mmol·L-1處理外，不同濃度甘氨酸處理的華王幼苗地上部及根系總氮含量均顯著高于五月慢。

與 對 照 相 比，2.5、5.0、10.0 mmol·L-1處理均顯著提高了華王幼苗地上部及根系的總碳含量；2.5、5.0 mmol·L-1處理的五月慢幼苗地上部及根系總碳含量亦均顯著高于對照，而20.0 mmol·L-1處理顯著降低了五月慢幼苗地上部及根系的總碳含量；不同濃度甘氨酸處理下，華王幼苗地上部和根系的總碳含量均顯著高于五月慢（表1）。

表1 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗干物質量、總氮含量及總碳含量的影響

2.3 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗硝酸還原酶（NR）活性的影響

硝酸還原酶是植物體內氮同化的關鍵酶之一，同時也是限速酶。圖1表明，不同濃度甘氨酸處理下，兩個普通白菜品種幼苗根系NR活性均高于地上部，這說明根系是NO3-還原的主要場所；除五月慢5.0 mmol·L-1處理外，兩個普通白菜品種幼苗地上部NR活性無顯著變化；2.5、5.0、10.0 mmol·L-1處理均顯著提高了兩個普通白菜品種幼苗根系NR活性，分別提高了125.6%、115.6%、112.5%和 129.3%、129.1%、106.6%；20.0 mmol·L-1處理的兩個普通白菜品種幼苗根系NR活性均與對照差異不顯著，其中五月慢幼苗根系NR活性比對照降低了5.5%。

圖1 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗硝酸還原酶（NR）活性的影響

圖柱上不同小寫字母表示差異顯著（α=0.05），下圖同。

2.4 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗谷草轉氨酶（GOT）活性的影響

圖2表明，隨著營養液中甘氨酸濃度的增加，兩個普通白菜品種幼苗地上部和根系GOT活性均呈先升高后降低的趨勢，但是地上部GOT活性無顯著變化，而根系GOT活性在2.5、5.0、10.0 mmol·L-1處理下顯著高于對照；華王幼苗根系GOT活性在2.5、5.0、10.0 mmol·L-1處理間差異不顯著，五月慢幼苗根系GOT活性則在2.5 mmol·L-1和10.0 mmol·L-1處理間差異不顯著。

2.5 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗谷丙轉氨酶（GPT）活性的影響

隨著營養液中甘氨酸濃度的增加，兩個普通白菜品種幼苗地上部GPT活性無顯著變化；2.5、5.0、10.0、20.0 mmol·L-1處理的華王幼苗根系GPT活性均顯著高于對照，分別提高了提高了122.9%、221.3%、235.1%和85.0%，其中2.5 mmol·L-1和20.0 mmol·L-1處理間差異不顯著，5.0 mmol·L-1和10.0 mmol·L-1處理間差異不顯著；與對照相比，五月慢幼苗根系GPT活性只在5.0 mmol·L-1和10.0 mmol·L-1處理下顯著提高，分別增加了137.6%和145.3%（圖3）。

2.6 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗谷氨酸合成酶（GOGAT）活性的影響

與對照相比，2.5、5.0、10.0 mmol·L-1處理均顯著提高了兩個普通白菜幼苗地上部GOGAT活性，20.0 mmol·L-1處理兩個普通白菜幼苗地上部GOGAT活性雖有提高，但差異未達顯著水平；與對照相比，2.5、5.0、10.0、20.0 mmol·L-1處理的華王幼苗地上部GOGAT活性分別提高了134.6%、205.0%、155.1%和25.7%，五月慢則依次提高了142.7%、127.1%、124.2%和23.8%；與地上部分相似，2.5、5.0、10.0 mmol·L-1處理均顯著提高了兩個普通白菜品種幼苗根系GOGAT活性，華王幼苗根系GOGAT活性在2.5、5.0、10.0 mmol·L-1處理間差異不顯著，五月慢幼苗根系GOGAT活性在2.5 mmol·L-1和10.0 mmol·L-1處理間差異不顯著（圖4）。

圖2 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗谷草轉氨酶（GOT）活性的影響

圖3 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗谷丙轉氨酶（GPT）活性的影響

1.7 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗谷氨酰胺合成酶（GS）活性的影響

圖5表明，與對照相比，2.5、5.0、10.0、20.0 mmol·L-1處理均顯著提高了兩個普通白菜品種幼苗地上部GS活性，分別提高了24.0%、45.2%、38.5%、28.8%和 28.4%、41.4%、40.5%、25.0%，其中5.0、10.0 mmol·L-1處理的兩個普通白菜品種幼苗地上部GS活性顯著高于2.5 mmol·L-1和20.0 mmol·L-1處 理；5.0 mmol·L-1和10.0 mmol·L-1處理的華王幼苗根系GS活性顯著高于對照，而五月慢在2.5 mmol·L-1和5.0 mmol·L-1處理下幼苗根系GS活性顯著高于對照。

圖4 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗谷氨酸合成酶（GOGAT）活性的影響

圖5 不同濃度甘氨酸對普通白菜幼苗谷氨酰胺合成酶（GS）活性的影響

3 結論與討論

氮是植物生長最重要的元素之一，氮素形態和供氮水平都會對作物產量和品質產生影響（G ü sewell，2004）。根據養分報酬遞減規律，所有營養元素對作物生長都有一個適宜的范圍。本試驗中，甘氨酸濃度在2.5～5.0 mmol·L-1范圍內，兩個普通白菜品種的干物質量、總氮含量和總碳含量總體表現為增加趨勢，高于5.0 mmol·L-1則呈下降趨勢，過高濃度（＞10.0 mmol·L-1）甘氨酸對普通白菜生長的促進作用有限，甚至限制普通白菜生長，說明在一定濃度范圍內甘氨酸可以作為普通白菜的氮源，能夠促進其生長，這與王華靜（2006）的研究結果普通白菜地上部鮮質量和干質量以及根鮮質量和干質量隨谷氨酰胺濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢相似。但葛體達等（2009）發現生長在無菌組培瓶中的番茄幼苗的植株干質量、總氮含量、游離氨基酸含量以及可溶性蛋白質含量均隨著甘氨酸濃度的增加而增加，并沒有受到高濃度甘氨酸的抑制，這可能是因為該試驗中的甘氨酸濃度（最高為6 mmol·L-1）還不夠高，沒有達到抑制植物生長的程度。本試驗中，5.0 mmol·L-1甘氨酸處理顯著促進兩個普通白菜品種生長，可以作為這兩個普通白菜品種適宜的氨基酸施用濃度。

氮同化關鍵酶活性是影響植物氮素利用能力的重要因素之一，GS-GOGAT循環及轉氨基作用可能在植物甘氨酸代謝中發揮重要作用，為此本試驗比較了不同普通白菜品種在不同甘氨酸濃度水平下幾個氮代謝酶活性的差異。硝酸還原酶（NR，EC 1.7.1.3）是植物體內氮代謝的關鍵酶，其活性通常隨著外源供應氮素的增加而增加。本試驗中，適宜濃度范圍內，甘氨酸處理顯著提高普通白菜幼苗根系NR活性，從而促進氮素的同化，有利于有機氮素在植物體內積累；兩個普通白菜品種幼苗地上部NR活性明顯低于根系，說明根系是NO3-還原的主要場所。谷草轉氨酶（GOT，EC 2.6.1.1）和谷丙轉氨酶（GPT，EC 2.6.1.2）也是植物氮素代謝的關鍵酶。本試驗中，甘氨酸濃度為2.5、5.0 mmol·L-1和10.0 mmol·L-1的處理對普通白菜幼苗地上部GOT、GPT活性無明顯影響，但隨著甘氨酸濃度的升高，根系GOT、GPT活性呈先上升后降低的趨勢，說明甘氨酸態氮濃度對普通白菜根系轉氨基作用影響較大；無氮處理（CK）的普通白菜幼苗根系GOT、GPT活性明顯低于地上部，說明缺氮抑制普通白菜根部轉氨基作用，而添加適宜濃度甘氨酸后，根系GOT、GPT活性顯著提高。王華靜（2006）采用外施不同濃度谷氨酰胺的方法，也發現普通白菜根系中GOT、GPT活性增加幅度遠高于地上部分。綜上，外施適宜濃度的甘氨酸或谷氨酰胺能夠顯著提高普通白菜根系轉氨基作用，吸收的氨基酸可能首先在根中進行轉氨基同化，再轉化為其他氨基酸。過高濃度甘氨酸（20.0 mmol·L-1）處理下，轉氨酶活性的增加幅度不如低濃度氨基酸處理，可能是高濃度甘氨酸供應下普通白菜生長受抑制的原因之一。

GS/GOGAT循環是植物體內將無機氮轉化成有機氮的主要途徑，特別是GS參與多種氮代謝的調節，是氮代謝中心的多功能酶，GS的活性受供氮量和氮素形態的影響（莫良玉 等，2001；Miflin & Habash，2002）。GS/GOGAT循環同樣也影響有機氮代謝，Thornton等（2007）認為植物吸收甘氨酸后除通過轉氨基作用直接參與其他氨基酸合成外，GS/GOGAT循環也是其主要代謝途徑，其中甘氨酸經GS/GOGAT循環代謝產生的NH4+首先合成天冬氨酸，然后進入到植物游離氨基酸庫參與其他氨基酸的合成或轉化。本試驗中，甘氨酸濃度在2.5～10.0 mmol·L-1范圍內，普通白菜幼苗地上部與根系的GOGAT、GS活性大多顯著高于對照，說明外施甘氨酸態氮能夠提高植物GOGAT和GS活性，促進植株GS/GOGAT循環過程。無氮處理（CK）的普通白菜幼苗根系GOGAT和GS活性大多高于地上部，說明低氮條件對普通白菜地上部GS/GOGAT循環抑制明顯。添加適宜濃度的外源甘氨酸后，普通白菜地上部和根系的GOGAT和GS活性均顯著增加，但過高的甘氨酸濃度（20.0 mmol·L-1）下GOGAT和GS活性增加很少或與對照差異不顯著，可能是其抑制普通白菜生長的又一原因。

本試驗結果還表明，不同品種普通白菜對甘氨酸態氮的利用能力不同。不同甘氨酸濃度下，華王幼苗干質量、總碳含量和總氮含量均明顯高于五月慢，說明華王具有更好的甘氨酸態氮吸收、利用能力。這可能與不同甘氨酸濃度下華王較高的氮代謝相關酶活性（NR、GPT、GOT、GS和GOGAT）有關。不同品種普通白菜對甘氨酸態氮利用能力的差異說明生產中有必要考慮品種差異，有差別地設計肥料配方；此外，品種間甘氨酸營養效應的差別也為通過品種篩選和改良，提高有機氮利用效率提供可行性。總之，本試驗驗證了前人的推測，并進一步豐富了普通白菜甘氨酸態氮營養效應機理，經普通白菜吸收后的甘氨酸可以通過NR、GOT、GPT在根中同化，還可以通過GS/GOGAT循環在根系和地上部分同化，從而促進普通白菜的生長和碳氮積累。

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Effects of Glycine Nitrogen Concentration on Pakchoi Seedling Growth and Key Enzyme Activity Involved in Nitrogen Metabolism

WANG Xiao-li1，2，ZHOU Qian2，HUANG Dan-feng2*

（1College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；2School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China）

A hydroponic experiment was conducted to study the effects of different glycine（Gly）concentrations on bakchoi〔Brassica campestirs L.spp.chinensis（L.）Makino var.communis Tsen et Lee〕seedling growth and nitrogen metabolism.The differences of dry matter，total N content，total carbon content and key enzyme activities involved in nitrogen metabolism in 2 pakchoi cultivars（‘Huawang'and‘Wuyueman'）and under 4 Gly concentration（0，2.5，5.0，10.0，20.0 mmol·L-1）were compared.The results indicated that the dry matter，total N content，total carbon content and key enzyme activities involved in nitrogen metabolism first increased then decreased with the increase of Gly concentration.Under 2.5-10.0 mmol·L-1Gly treatment，the dry matters，total N contents，total carbon contents，the activities of glutamine synthetase and glutamate synthase，and root nitrate reductase，root glutamic-pyruvate transaminase，root glutamic oxalo-acetic transaminase of the 2 pakchoi cultivars were generally significantly higher than that of the contrast.Under 20.0 mmol·L-1Gly treatment，the dry matters，total contents of N and C and the activities of most enzymes for both cultivars showed no significant difference with those in the contrast，while the dry matter，total N and C content of‘Wuyueman'were lower than that of the contrast.These results clearly demonstrates that suitable Gly concentration can promote the accumulation of N and C and promote pakchoi growth with relatively greater activities of nitrate reductase，glutamicpyruvate transaminase，glutamic oxalo-acetic transaminase in roots and GS-GOGAT cycle in both shoots and roots.

Pakchoi；Glycine concentration；Nitrate reductase；Aminotransferase；Glutamine synthetase；Glutamate synthase

）：黃丹楓，女，博士，教授，博士生導師，專業方向：設施園藝技術、蔬菜生理生態，E-mail：hdf@ sjtu.edu.cn

上海市自然科學基金項目（15ZR1431300）

王小麗，女，博士，講師，專業方向：植物營養生理與生態，E-mail：wxl2006by@163.com

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2016-03-17；接受日期：2016-05-20