湖南省草莓灰霉病菌遺傳多樣性研究

劉雙清王 翀張 亞廖曉蘭，4*馬文月柏連陽

（1湖南農業大學植物保護學院，湖南長沙 410128；2植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；3湖南農業大學理學院，湖南長沙 410128；4湖南省生物農藥與農藥制劑加工工程技術研究中心，湖南長沙 410128）

湖南省草莓灰霉病菌遺傳多樣性研究

劉雙清1，2王 翀3張 亞1*廖曉蘭1，2，4*馬文月1柏連陽1

（1湖南農業大學植物保護學院，湖南長沙 410128；2植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；3湖南農業大學理學院，湖南長沙 410128；4湖南省生物農藥與農藥制劑加工工程技術研究中心，湖南長沙 410128）

為探明湖南省草莓灰霉病菌群體遺傳結構、分化及變異規律，采用熒光標記技術對湖南省9個地理菌群的180株草莓灰霉病菌基因組DNA進行SSR分析。結果表明：9對SSR引物共檢測到56個觀察等位基因（Na），平均值為6.22；有效等位基因（Ne）為1.27～4.89，平均值為3.44；不同位點的基因多樣性指數（H）為0.21～0.80，平均值為0.65；不同位點Shannon's信息指數（I）為0.37～1.83，平均值為1.34。供試180株樣品9個SSR多態性位點上多態性信息量PIC變化范圍為0.13～0.91，不同位點PIC差異大，這一規律與I和H基本一致。不同SSR位點總的遺傳多樣性（Ht）為0.21～0.77，平均值為0.65；群內遺傳多樣性（Hs）為0.19～0.50，平均值為0.40；遺傳分化系數（Gst）為0.10～0.46，平均值為0.37；基因流（Nm）為0.58～4.47，平均值為1.16。不同地理菌群平均觀察等位基因（Na）、有效等位基因數目（Ne）分別為2.93和2.07，Shannon's信息指數（I）平均為0.67，基因多樣性指數（H）平均為0.40，平均多態性位點數（NP）、多態位點百分率（P）分別為6.78和75%。依據不同地理菌群之間的遺傳距離（0.279 7～1.922 5），將供試湖南省9個地理菌群分為4大類：第Ⅰ大類主要由長沙、邵陽、岳陽、衡陽、張家界、湘潭種群組成；第Ⅱ大類主要由郴州種群組成；第Ⅲ大類主要由株洲種群組成；第Ⅳ大類由常德種群組成?？傊?，湖南省各地草莓灰霉病菌群體遺傳多樣性豐富，但地理群體間差異小，病菌遺傳變異主要來自群體內部，不同地區間存在病菌的移動。

湖南省；草莓灰霉病菌；遺傳多樣性；SSR標記

草莓灰霉病是草莓的重要病害之一，是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的真菌性病害，該病菌既有致病性也有腐生性，寄主范圍廣泛，可為害黃瓜、番茄、辣椒等200多種寄主植物，每年造成的損失可達10%～30%，嚴重的甚至達到89% （Ugolini et al.，2014）。草莓灰霉病菌不僅適應性強、繁殖速度快、菌源量大，而且易受外界環境條件的影響發生變異，往往難以控制（Rosslenbroich & Stuebler，2000）。因此，研究草莓灰霉病菌遺傳結構、遺傳分化、遺傳變異以及與地理、氣候、品種、管理等因素的關系，成為明確草莓灰霉病菌起源、演化規律、傳播規律以及制定防控方案的關鍵問題。近年來，國內外許多研究開始關注草莓灰霉病菌的多樣性研究。Ma和Michailides（2005）利用MP-PCR技術研究了美國佛羅里達州不同寄主上灰霉病菌菌群遺傳結構，認為不同寄主上灰霉病菌分化程度高，一些菌群不能聚集一起，而且菌群重組方法不一致。余文貴等（2011）研究了江蘇省草莓灰霉病菌的多樣性，認為采用SSR技術聚類的結果與采集樣本具有高度的一致性，但是其研究不系統，仍有很多指標未研究。Isenegger等（2008）利用不同的轉座子類型對南亞和澳大利亞地區灰霉病菌進行了多樣性研究，發現不同地區灰霉病菌具有地理差異性，而且可以將相似的物種進行分類。Walker等（2015）研究認為灰霉病菌多樣性與地理特征之間有一定聯系，但不是必然聯系，而且與不同地區的寄主植物也有一定聯系。Ahmed和Hamada（2005）通過分子標記技術研究了突尼斯不同寄主植物上灰霉病菌的多樣性，并利用轉座子方法證實了存在兩種不同的菌群。

SSR標記技術具有精確度高、可靠性強、簡單、等位點多樣性好等特點，可用于多種植物病原菌的遺傳多樣性研究（沈瑛 等，2004；胡小平 等，2008；徐靜靜 等，2008；趙志堅 等，2008）。湖南省處于長江流域地區，其地理特征和氣候特征顯著不同于其他地區，各地地形復雜多樣，氣候濕度較高，極易形成低溫高濕的環境條件，從而造成草莓灰霉病的發生和流行。目前，有關湖南省草莓灰霉病菌多樣性的研究未見報道，而且已有的研究多采用RAPD技術，但這種技術與SSR技術比較，具有一定的局限性（Moyano et al.，2003）。本試驗采用SSR技術研究湖南省各地草莓灰霉病菌遺傳多樣性，旨在了解灰霉病菌遺傳差異與地理位置之間的關系，明確病菌遺傳結構和分化程度以及相關演化規律，并為今后指導農業生產合理用藥，制定防控方案提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試草莓灰霉病菌菌株分別于2013～2015年每年的2～5月采集自湖南省岳陽、常德、郴州、衡陽、湘潭、株洲、邵陽、長沙、張家界等9個草莓種植區，每個地區采集20株菌株，共計180株，草莓灰霉病較重的地塊采集典型草莓灰霉病果。

1.2 試驗方法

1.2.1 病樣處理與菌株分離 將采集的病樣帶回湖南農業大學植保學院植病實驗室，利用單孢分離法，用挑孢針的針尖在產生分生孢子的典型草莓灰霉病病果（也可將待發病病果組織的一部分置于PSA培養基上，20～23 ℃條件下黑暗培養6～7 d，可產生分生孢子）表面輕輕碰抹一下，粘附孢子，在四方形薄PSA平板培養基（蔗糖19 g，馬鈴薯200 g，瓊脂17 g，水1 000 mL）的對角線輕輕劃一下，將孢子粘附在薄瓊脂平板上，接著將薄瓊脂平板置于顯微鏡下，尋找分散的孢子，用挑孢針的針尖碰觸單個分生孢子，轉移至準備好的PSA斜面培養基上，室溫培養2～3 d長出單個菌落，標上記號，放入4 ℃冰箱備用（張君成，2008；陸寧海等，2009）。

1.2.2 草莓灰霉病菌基因組DNA提取 采用Fournier等（2002）的方法并做適當修改后提取草莓灰霉病菌基因組DNA。主要修改之處為：將新鮮菌絲研磨后迅速將菌液移入1.5 mL的離心管中，于65 ℃下水浴40 min，水浴過程中顛倒3～4 次；加等體積的氯仿∶異戊醇混合液（24 V∶1 V）充分混勻，4 ℃下13 000 r·min-1離心5 min；將上清液移至另一新的離心管中，加 2.5倍體積的冰凍無水乙醇，輕輕搖勻，等沉淀出現后，4 ℃下10 000 r·min-1離心5 min；棄上清液，沉淀用70%酒精洗滌2～3次，在電烤爐的上方30 cm處烘干，加50～100 μL的TE緩沖液（含10 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA，pH=8.0）充分溶解（如果溶解較慢可置于37 ℃水浴器中促溶）；其他方法均相同。

1.2.3 SSR分析 采用熒光標記技術對采集到的湖南省9個地理菌群的180株草莓灰霉病菌基因組DNA進行SSR標記分析，根據Fournier等（2002）設計的SSR引物，經預試驗從10對草莓灰霉病菌引物中篩選出9對多態性好、條帶清晰穩定的引物（表1）用于所有草莓灰霉病菌SSR-PCR擴增，所使用的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系（25 μL）：10×Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）2.5 μL，dNTPs（10 mmol·L-1）0.5 μL， 上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，Taq聚合酶（TAKARA，5 U·μL-1）0.2 μL， 模 板DNA （50 ng·μL-1）1.0 μL，ddH2O 17.3 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10個循環；95℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，20個循環；72 ℃延伸6 min，4 ℃終止反應。所得PCR產物經3730XL測序儀（美國ABI公司）進行遺傳多樣性分析。

1.2.4 數據統計與分析 利用PopGene Version 1.32軟件計算以下參數：多態性位點數NP （number of polymorphic loci），多態位點百分率P （proportion of polymorphic loci），有效等位基因數目Ne（effective number of alleles），基因多樣性指數H （gene diversity），Shannon's信息指數I（shannon'sinformation index），Neis遺 傳 距 離 GD（genetic distances），遺傳分化系數Gst。另外，通過公式PIC=1-∑Pi2（Pi表示等位基因頻率）計算多態性信息量PIC。NTSYSpc-2.11F軟件進行數據分析，用SHAN程序中的UPGMA（Unweighted Pair-Group Mean Average，非加權算術平均聚類）方法進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖。

表1 供試SSR引物信息

2 結果與分析

2.1 SSR位點遺傳多樣性

由表2可知，9對SSR引物對湖南各地草莓灰霉病菌進行檢測共發現56個觀察等位基因，其中BC3、BC5、BC6引物擴增的觀察等位基因數最多，達到9個，但BC1僅為2個，位點平均等位基因6.22個。有效等位基因（Ne）1.27（BC1位點）～4.89 （BC3位點），平均有效等位基因3.44。不同位點的基因多樣性指數（H）不同，其中BC2、BC3位點值最大，為0.80；BC1位點值最小，為0.21；平均值為0.65。不同位點Shannon's信息指數（I）差異大，BC3引物的I值最高為1.83，BC1的I值最低為0.37，位點平均值為1.34。供試的180株樣品9個SSR多態性位點上多態性信息量PIC變化范圍為0.13～0.91，不同位點PIC差異大，這一規律與I和H基本一致。結果表明湖南省各地草莓灰霉病菌的遺傳多樣性十分豐富。

表2 各SSR位點在湖南省9個地理草莓灰霉病菌群的遺傳多樣性和多態性信息量

2.2 草莓灰霉病菌群體遺傳多樣性水平

由表3可知，不同SSR位點總遺傳多樣性（Ht）范圍為0.21～0.77，平均值為0.65；群內遺傳多樣性（Hs）范圍為0.19～0.50，平均值為0.40；遺傳分化系數（Gst）范圍為0.10～0.46，平均值為0.37；基因流（Nm）范圍為0.58～4.47，平均值為1.16。其中BC2和BC9標記的灰霉病菌群遺傳分化程度大，基因流??；BC1標記的菌群遺傳分化程度小，基因流大；BC3標記的菌群總遺傳多樣性程度和群內遺傳多樣性分別為0.80、0.49，遺傳分化系數為0.38，基因流為0.82；BC6標記的總遺傳多樣性為0.76，但群體內遺傳分化程度最高為0.50，遺傳分化系數為0.34，基因流為0.97；BC4、BC5、BC7、BC10總遺傳多樣性程度介于0.50～0.77之間，群內遺傳分化多樣度介于0.28～0.48之間，遺傳分化介于0.36～0.44之間，基因流介于0.64～0.87之間。這表明湖南省草莓灰霉菌不同地理菌群間病原菌相互交流十分頻繁。

表3 各SSR位點內湖南省草莓灰霉病菌群體遺傳分化及基因流

2.3 草莓灰霉病菌地理菌群遺傳多樣性

地理菌群遺傳多樣性研究結果顯示（表4），湖南省草莓灰霉病各地理菌群的遺傳多樣性比SSR位點遺傳多樣性低。從地理菌群水平上分析，平均觀察等位基因（Na）、有效等位基因數目（Ne）分別為2.93和2.07，Shannon's信息指數（I）平均為0.67，基因多樣性指數（H）平均為0.40，平均多態性位點數（NP）、多態位點百分率（P）分別為6.78和75%。長沙菌群Shannon's信息指數（I）最高，達到1.29；邵陽菌群次之，為0.91；而常德菌群最低，為0.04，表明地形復雜的山區草莓灰霉病菌菌群比地勢平坦地區的菌群更為豐富、具有更高的遺傳多樣性水平。

表4 湖南省草莓灰霉病菌群地理群體的遺傳多樣性

2.4 不同地理菌群間的遺傳距離和遺傳一致度

如表5所示，湖南省各地草莓灰霉病菌群間的遺傳距離在0.279 7～1.922 5之間，遺傳一致度在0.146 2～0.756 0之間，這說明湖南省各地理菌群間遺傳一致度較低，遺傳分化程度較高。郴州菌群和常德菌群之間的遺傳一致度最小為0.146 2，邵陽菌群和長沙菌群之間的遺傳一致度最大為0.756 0；在遺傳距離上，邵陽菌群和長沙菌群的遺傳距離最低僅為0.279 7，而常德菌群和郴州菌群的遺傳距離較高為1.520 1。說明遺傳距離與草莓灰霉病菌群的地理經度無明顯的關系，但與地理緯度有一定的相關性，特別是不同地區小氣候、土壤酸堿度、風速、溫濕度、品種以及栽培方式等外界條件可能是導致草莓灰霉病菌菌群遺傳分化的重要因素。

表5 湖南省草莓灰霉病菌不同地理群的遺傳距離和遺傳一致度

2.5 聚類分析

由圖1可知，湖南省9個地理菌群可以分為4大類。第Ⅰ大類主要由長沙、邵陽、岳陽、衡陽、張家界、湘潭種群組成；第Ⅱ大類由郴州種群組成；第Ⅲ大類由株洲種群組成；第Ⅳ大類由常德種群組成。說明湖南各地菌群分類與地球緯度有一定相關性，第Ⅱ大類菌群位于緯度的最南端，其次為第Ⅲ大類菌群，第Ⅰ大類菌群位于緯度的偏北端，第Ⅳ大類菌群位于緯度的最北端。第Ⅰ大類菌群由湖南中部偏北的6個菌群組成，既有地勢較高的山區，也有地勢較低的平原，說明這些菌群遺傳距離較小，遺傳分化程度低，基因流大，病菌傳播未受到地理阻隔；第Ⅱ大類菌群郴州菌群、第Ⅲ大類菌群株洲菌群與第Ⅳ大類菌群常德菌群的相似性比較低，基因的流動或漂移受到地理條件的阻隔。

圖1 不同草莓灰霉病菌地理菌群的聚類分析結果

3 結論與討論

傳統植物病原真菌的多樣性研究主要根據病原真菌在不同鑒別寄主上的致病性差異進行，不屬于生物學上的自然分類，不能反映遺傳背景，而且不同的鑒別寄主和環境條件，獲得的結果差異較大（李亞，2006）。采用SSR技術分析生物遺傳多樣性具有很多優勢，如：不受時空限制、檢測效率高，其反映的是基因型差異，而且檢測靈敏度高，檢測可信度強，還能降低反復檢測費用，分析量大，特別適合大規模群體樣品的標記（關玲 等，2011）。

本試驗首次采用SSR技術研究了湖南省各地草莓灰霉病菌的遺傳多樣性、遺傳結構、遺傳分化規律、遺傳距離以及聚類概況。結果顯示，湖南省各地草莓灰霉病菌具有豐富的遺傳多樣性，其中共檢測到56個觀察等位基因，有效等位基因為1.27～4.89，多態性信息量為0.13～0.91，基因多樣性指數為0.21～0.80，Shannon's信息指數為0.37～1.83。說明SSR標記技術具有高效性和準確性，這種微衛星標記上的差異可以用來分析菌株之間的遺傳關系。Hovmller等（2008）研究結果表明：不少因素都可影響植物病原菌的遺傳結構和多樣性，如寄主、基因流、自然選擇、遺傳漂變、交配系統等因素協同作用，而且不同區域地理特征也影響植物病原菌的遺傳多樣性和遺傳結構。在田間草莓灰霉病菌的有性世代很少出現，病菌個體之間主要依賴無性繁殖，無基因交流，生殖上是隔離的，這不利于遺傳變異，但本試驗發現湖南省各地的草莓灰霉病菌具有遺傳多樣性，說明這些變異主要來自多樣性的地理特征、強烈紫外線照射、準性生殖、異核現象、農用化學品的不規范使用，也可能來自有性雜交（Enjalbert et al.，2005）。

遺傳變異是種群多樣性的重要因素。本試驗結果說明湖南省各地草莓灰霉病菌群體遺傳分化程度不同，其中總遺傳多樣性Ht平均值為0.65，群內的遺傳多樣性Hs平均值為0.40，群體內遺傳分化系數Gst平均值為0.37。表明湖南省草莓灰霉病菌的遺傳變異程度低，而且群體內存在遺傳分化程度不高，可能各地的遺傳背景或演化路徑有相同之處。湖南省各地草莓灰霉病菌群內基因流Nm比較高，平均值為1.16，進一步證實菌群內基因交流頻繁，這可能跟草莓灰霉病菌源量大，繁殖快，孢子可借助空氣高空遠距離傳播，或跟雨水、運輸、人員來往，或跟不同莓農購買區域外品種等因素有關，物種的差異性降低（曹支敏 等，2012）。

本試驗結果還證實，湖南省各地理菌群間遺傳多樣性比SSR位點遺傳多樣性低，而且不同地理菌群間信息指數無規律。其次，不同菌群間具有較低的遺傳分化和較高的遺傳一致度。這表明菌群間的多樣性與地理特征有一定聯系，但不是必然聯系，也可能跟以下幾種因素有關：① 從群體間分析，在田間草莓灰霉病菌無性繁殖發達，幾乎找不到有性生殖體，基因變異的幾率小，保持了種的穩定性；② 從群體間分析，整個湖南省都處于雨區，全年日照次數較少，紫外線不足，導致病菌變異的可能性減少；③ 可能跟保護地栽培方式、品種、復雜的結構、獨立群體等有關。

聚類分析結果表明：相同經度或緯度的區域草莓灰霉病菌遺傳相似度高，遺傳距離小，聚為一類。大體上處于同一經度下的長沙、邵陽、湘潭、岳陽、衡陽、張家界為一類，可能跟這些地區經濟發達，管理水平高、南北人員交往密集、草莓種苗的購買和調運有關，但邵陽和張家界為何能和其他幾個地區聚為一類，畢竟有山脈隔離，理論上應該不屬于同一類，可能這些地區屬于草莓種植新區，跟草莓引種時攜帶的病原菌有關。然而，郴州、株洲、常德地區則單獨成群，這些地區與其他地區能很好地分開，可能跟當地的氣候特征、栽培、抗病品種、傳播、病菌起源有關。

探明植物病原菌群體動態及演化規律對于制定有效防病方案具有重要價值（王玲 等，2015）。本試驗結果表明湖南省草莓灰霉病菌具有遺傳多樣性，但不同地理群體間多樣性差，說明該地區變異的草莓灰霉病菌還未形成群體，只是個體間具有多樣性，其進化的水平低，病害防治相對比較容易。盡管從理論上講，草莓灰霉病菌進化的幾率慢，但是不少研究證實草莓灰霉病菌易產生抗藥性，防治草莓灰霉病的任務刻不容緩。在防治草莓灰霉病策略方面，應注意前期清除病原、種植抗病品種、土壤消毒、合理密植、適當施肥、經常通風透光等；其次，還要考慮不同地區遺傳變異的差異性；另外，注意使用新藥劑或藥劑的混用或輪用，以提高防效，減少經濟損失（李延剛 等，2013）。

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Studies on Genetic Diversity of Strawberry Mould from Botrytis cinerea in Hunan Province

LIU Shuang-qing1，2，WANG Chong3，ZHANG Ya1*，LIAO Xiao-lan1，2，4*，MA Wen-yue1，BAI Lian-yang1

（1College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；2Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Plant Pests，Changsha 410128，Hunan，China；3Science College of Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；4Biological Pesticides and Pesticide Preparation Processing Engineering Technology Research Center of Hunan Province，Changsha 410128，Hunan，China）

In order to investigate the genetic structure of srawberry mould from Botrytis cinerea，its differentiation and veriation regulatory，this paper carried out SSR marker analysis on DNA of 180 srawberry mould from Botrytis cinerea genomes，collected from 9 locations of Hunan Province.The result indicated that a total of 56 alleles（Na）for 9 SSR loci were detected，the average value was 6.22.The effective number of alleles（Ne）ranged from 1.27-4.89，with an average value of 3.44.The Nei's gene diversity（H）varied from 0.21-0.80，with an average value of 0.65.The Shannon's information index（I）varied from 0.37-1.83，with an average value of 1.34.The polymorphism information content（PIC）for 9 loci ranged from 0.13-0.19，the variation law was generally coincident with the Shannon's information（I）index and gene diversity index（H）.The denote gene diversity in the species（Ht）of different SSR loci ranged from 0.21-0.77，with an average value of 0.65.The gene diversity within populations（Hs）varied from 0.19-0.50，with an average value of 0.40.The population genetic differentiation（Gst）varied from 0.10-0.46，with an average value of 0.37.The gene flow （Nm）ranged from 0.58-4.47，with an average value of 1.16.At geographical population level，the observed number of alleles（Na）and the effective number of alleles（Ne）were 2.93 and 2.07，respectively.The average Shannon's information index（I）and Nei's gene diversity index（H）were 0.67 and 0.40，respectively.The number of polymorphic loci（NP）and the proportion of polymorphic loci（P）were 6.78 and 75%，respectively.Based on Nei's genetic distance（ranging from 0.279 7-1.922 5），9 geographical populations of MLP isolates from different regions in Hunan Province were initially grouped into 4 clusters：cluster Ⅰ included isolates Changsha，Shaoyang，Yueyang，Hengyang，Zhangjiajie and Xiangtan，cluster Ⅱ included isolates Chenzhou，cluster Ⅲincluded isolates Zhuzhou，and cluster Ⅳcomprised Changde.The genetic diversity of Botrytis cinerea population from Hunan Province is very rich，but there are small differences between different geographical population.The genetic variation in bacteria mainly comes from inside population，and Botrytis cinerea moves between different areas.

Hunan province；Botrytis cinerea；Genetic diversity；SSR marker

s）：張亞，男，副教授，主要從事植物病害綜合治理方面的研究，E-mail：zhangya230@126.com；廖曉蘭，女，教授，博士生導師，主要從事植物病害綜合治理方面的研究，E-mail：liaoxl88@126.com

公益性行業（農業）科研專項（201303025）

劉雙清，男，講師，主要從事植物病害綜合治理方面的研究，E-mail：liushuangqing104@163.com

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2016-03-28；接受日期：2016-05-10