水楊酸對蛇龍珠葡萄白藜蘆醇誘導合成的影響

丁玲，秦晨亮，代紅軍*（寧夏大學農學院/寧夏大學葡萄與葡萄酒教育部工程中心，銀川 750021）

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水楊酸對蛇龍珠葡萄白藜蘆醇誘導合成的影響

丁玲，秦晨亮，代紅軍*
（寧夏大學農學院/寧夏大學葡萄與葡萄酒教育部工程中心，銀川 750021）

摘 要：為了研究水楊酸（SA）對蛇龍珠葡萄白藜蘆醇合成的影響，以蛇龍珠葡萄果實為試材，在漿果生長期設置0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的水楊酸處理，測定果皮和果籽中白藜蘆醇的含量，并探討白藜蘆醇與苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）活性的關系。結果表明：在蛇龍珠葡萄發育過程中，果皮和果籽中的白藜蘆醇含量出現2次高峰，分別出現在花后35 d和花后80 d；PAL和C4H活性的變化與白藜蘆醇含量變化相似；不同質量濃度的水楊酸處理對蛇龍珠葡萄有明顯的誘導效果，其中果皮中白藜蘆醇含量以50 mg/L水楊酸誘導效果最佳，果籽中白藜蘆醇含量以25 mg/L水楊酸誘導效果相關最佳。由此推斷，適量的水楊酸處理能夠激活PAL和C4H的活性，進一步提高白藜蘆醇的含量。

關鍵詞：水楊酸；蛇龍珠；白藜蘆醇；PAL；C4H

白藜蘆醇是植物對不良環境適應而產生的一種植物抗毒素［1］。正常情況下，白藜蘆醇的合成很少，當環境惡化（如真菌感染、紫外線照射、植物生長脅迫劑的作用、機械損傷等）以及外源刺激時均會誘導白藜蘆醇的合成［2-4］。研究發現，白藜蘆醇來源于苯丙烷代謝途徑，而在苯丙烷類代謝途徑中有多種酶參與，而起關鍵性作用的是苯丙氨酸解氨酶（PAL）和肉桂酸-4-羥化酶（C4H）［5］。PAL是一種誘導酶，它能催化苯丙氨酸代謝途徑的第一步反應，是初生代謝和苯丙烷類代謝途徑的樞紐，可以受多種外界因素的誘導［6-7］；C4H催化苯丙氨酸途徑的第二步反應，同時也是該途徑的第一個氧化反應［8-9］，在植物生長發育過程中，如遭遇激發子、真菌感染、機械損傷及化學誘導，其編碼基因mRNA積累水平的變化趨勢與PAL趨于一致［10-11］。

水楊酸（Salicylic acid，SA）是植物界中廣泛存在的一種小分子酚類物質，對植物生長發育過程中開花、側芽萌發及性別分化等有重要的調節作用［12］，并已被確認為植物激素類的新成員。水楊酸不僅可調節植物的生長發育，還能誘導植物產生抗逆性，抵抗不良因素造成的傷害［13］。王定景等［14］研究表明，外源SA通過調節金線蓮抗氧化酶系統能有效緩解高溫脅迫對金線蓮的傷害。申勛宇［15］研究表明，適當濃度水楊酸處理可以使冬棗保持較高的可溶性糖和VC含量，延緩冬棗的衰老進程。劉玲等［16］研究表明，外源噴施SA明顯提高了庫爾勒香梨的硬度和可滴定酸含量，降低了可溶性固形物的含量。目前對SA的研究主要集中在生理效應、植物體內的運轉與分布以及一些作用機制，而對其提高葡萄白藜蘆醇含量的研究較少。因此本試驗以寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄蛇龍珠為試材，研究外源水楊酸處理對其果實在生長發育過程中白藜蘆醇含量的影響，以期篩選出外源水楊酸最佳濃度，從而增加釀酒葡萄蛇龍珠白藜蘆醇含量，對提高釀酒葡萄的經濟價值具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及地點

本試驗于2014年在寧夏大學葡萄與葡萄酒教育部工程中心玉泉營基地進行，以5年生蛇龍珠為試材，選擇生長健壯的植株，正常的水肥管理。冬季進行埋土防寒，采用倒“L”整形，株行距為0.5 m×3.0 m。單臂籬架栽培，每10～15 cm留1個結果枝，每個結果枝留1穗果。

1.2 試驗設計

供試藥劑設4個處理：25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的水楊酸，并以清水處理作對照。每處理選取生長勢基本一致的葡萄10株，在每株樹的不同方位選擇生長基本一致的10穗葡萄進行標記，試驗設3次重復。

分別在花后10 d，以不同質量濃度的水楊酸噴施葡萄果穗，并以清水做對照。處理于2015年7月2日進行樣品采集，以后每隔15 d采樣1次，直至果實采收。每次采樣時，均在標記的葡萄果穗上，選取不同著生方向的上、中、下部位采集果粒，放入冰盒后帶回實驗室，液氮冷凍，-80 ℃冰箱保存待用。

1.3 測定方法與指標

1.3.1 白藜蘆醇的測定

參照陳建業［17］的方法，并加以改進。

將葡萄果實放入95 ℃的水中熱燙30 s后取出，用手將果皮剝離，精確稱取果皮1 g，放入研缽中，加入3 mL甲醇以及少許的石英砂進行研磨，到勻漿為止，再用3 mL甲醇轉移到刻度試管中，在超聲波條件提取30 min。然后在超低溫離心機中離心（12 000 r/min，20 min）。將上清液取出，在40 ℃下進行旋轉蒸發，干燥物用甲醇1 mL進行溶解，HPLC待測。在避光條件下進行全部的操作，從而防止白藜蘆醇進行異構化。

高效液相色譜（HPLC）條件。色譜儀：安捷倫AGILENT1100型；色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）；檢測波長：306 nm；流動相：甲醇/水（40/60，v/v），等度洗脫，流速 1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為20 μL，每一個樣品進樣之前，先用流動相進行15 min平衡。白藜蘆醇采用外標法定量和標準品定性。白藜蘆醇標準品購于上海源葉生物科技有限公司。

標準溶液的配制。先稱5 mg白藜蘆醇的標準品，放于50 mL容量瓶中，加入少量色譜甲醇溶解，定容到刻度，最后配制成濃度為100 mg/L的標準溶液作為儲備液。分別取儲備液1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、16 mL置于100 mL的容量瓶中定容至刻度，從而得到濃度分別為1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L的標準溶液，以HPLC檢測的相同滯留時間處的峰面積作為標曲縱坐標，以標樣濃度為標曲的橫坐標，進一步繪制標準曲線。

1.3.2 PAL的測定

參照金麗萍等［18］的方法。

分別稱取果皮0.2 g和果籽0.2 g，研缽預冷，加入硼酸緩沖液2 mL（0.1 mol/L，pH8.8）和聚乙烯吡咯烷酮0.02 g，其中緩沖液中含有5 mmol/L巰基乙醇，l mmol/L EDTA。將樣品冰浴研磨成勻漿，在4 ℃下10 000 r/min離心15 min，轉移上清液至新的試管中即得到酶粗提取液。反應體系中包括2 mL硼酸緩沖液（0.1 mol/L，pH8.8），0.8 mL L-苯丙氨酸（0.02 mol/L），0.1 mL酶粗提液，以不加酶液為對照，進而改加蒸餾水0.1 mL。在30 ℃條件下水浴30 min后，加入鹽酸（6 mol/L）0.2 mL進行終止反應，于290 nm處測吸光值。按以下公式來計算酶的比活力。

酶的比活力：0.01△A/（mg·h）=△A×D/0.01×M×T，其中：△A為在一定時間內吸光度的變化；M為樣品鮮質量；T為反應時間；D為反應液的稀釋倍數，即所提取的總酶液為反應酶液的倍數。

1.3.3 C4H的測定

參照Lamb等［19］的方法。

分別稱取果皮0.2 g和果籽0.2 g，加入預冷的5 mL提取液，該提取液包括 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.6）和5 mmol/L巰基乙醇，加入石英砂和少量的PVP，將研缽放在冰上，進行研磨至勻漿，于超低溫離心機中10 000 r/min離心20 min，轉移上清液至試管中測定酶活性。反應液組為：2.2 mL的0.05 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.6，含反式肉桂2 μM，NADPNa22 μM，G-6-P-Na25 μM），在反應液反應開始前用25 ℃預溫5 min后，加0.8 mL酶液即開始反應。25 ℃反應30 min，加0.1 mL 6 mol/L HCl終止反應，10 000 r/min離心10 min，取上清液在340 nm下比色。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2007和DPS 7.5軟件進行統計分析，鄧肯氏法進行了多重比較。不同的小寫字母表示差異的顯著性。

2 結果分析

2.1 蛇龍珠葡萄生長發育過程中白藜蘆醇含量的變化規律

由圖1可知，蛇龍珠葡萄果皮和果籽在發育過程中，白藜蘆醇含量呈雙峰型變化，在花后35 d和花后80 d出現峰值。果皮在花后50 d白藜蘆醇含量最低，進入成熟期后（花后95 d）其含量呈下降趨勢。果籽白藜蘆醇含量最低值出現在花后65 d，進入成熟期后，白藜蘆醇也呈現下降趨勢。從整體來看，蛇龍珠葡萄果皮中白藜蘆醇含量高于果籽。

圖1 蛇龍珠果實發育過程中白藜蘆醇含量變化

2.2 水楊酸對蛇龍珠葡萄白藜蘆醇含量的影響

圖2 水楊酸處理對蛇龍珠葡萄果皮（A）、果籽（B）白藜蘆醇含量的影響

由圖2可知，水楊酸處理蛇龍珠葡萄后，能夠改變其白藜蘆醇的含量，但未改變其變化趨勢。蛇龍珠葡萄果皮和果籽中白藜蘆醇含量變化在花后80 d達到最大值，之后開始下降。在花后35 d出現一個小高峰，低于花后80 d。其中，50 mg/L 和100 mg/L的水楊酸處理蛇龍珠葡萄后，在花后80 d果皮中白藜蘆醇含量分別達到14.09 μg/g和13.43 μg/g，與對照相比，分別提高了45%和39%。另外，果皮中白藜蘆醇含量除了在花后80 d時水楊酸處理對其影響比較顯著之外，還在花后50 d時，25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L的水楊酸處理使得蛇龍珠葡萄果皮中白藜蘆醇含量相對于對照組依次顯著提高了57%、48%和33%，除去花后50 d和80 d之外的時期，水楊酸對蛇龍珠葡萄果皮中白藜蘆醇含量的影響幾乎不顯著。與果皮不同，經25 mg/L的水楊酸處理后，花后80 d果籽中白藜蘆醇含量達到最大值為11.59 μg/g，與對照相比，顯著地提高了84%；而在花后50 d和65 d時也極顯著地提高了65%和104%，其它時期各組之間的差異不太顯著。

2.3 水楊酸對蛇龍珠葡萄中PAL活性的影響

由圖3可知，蛇龍珠葡萄經水楊酸處理后，PAL活性的變化和白藜蘆醇含量變化大致相同。與對照相比，經水楊酸處理蛇龍珠葡萄后，果皮和果籽中PAL活性明顯提高，但未改變其變化趨勢，其中，在經過花后35 d的一個小高峰之后，在花后50 d時PAL活性都出現一個低值，分別為3.59 U/（mg·h）和2.31 U/（mg·h）；并在花后80 d，果皮和果籽中PAL活性分別達到最大值為22.18 U/（mg·h）和22.43 U/（mg·h），相對于對照組，分別提高了27%和16%，各處理組與對照組的PAL活性差異顯著。

圖3 水楊酸處理對蛇龍珠葡萄果皮（A）、果籽（B）PAL活性的影響

2.4 水楊酸處理對蛇龍珠葡萄中C4H活性的影響

由圖4可知，蛇龍珠果皮C4H活性呈雙峰型變化，在花后80 d達到最大峰值，且3個濃度處理的C4H活性相差不大，其中經100 mg/L水楊酸處理使果皮中C4H活性在花后80 d達到最大值8.73 U/（mg·h）；與對照相比，C4H活性提高了55%，之后成下降趨勢。果籽C4H活性的變化與果皮不同，在花后35 d呈現一個最低值0.44 U/（mg·h），之后隨著果實的發育，呈上升趨勢，達到最大值2.67 U/（mg·h）；相對于對照組，100 mg/L水楊酸處理使得C4H活性提高了101%，但100 mg/L的水楊酸處理使得果籽C4H活性變化幅度太大，不夠穩定，而25 mg/L水楊酸處理使得果籽中C4H活性穩定增加，尤其在花后50 d，進入成熟期后，25 mg/L水楊酸處理組的C4H活性趨于穩定。

3 討論與結論

李婷等［20］對不同品種葡萄不同部位的白藜蘆醇含量進行了測定和比較，結果表明：不同組織部位白藜蘆醇含量差異較大，其含量由高到低的順序為果皮＞種籽＞葉柄。本研究結果表明：蛇龍珠葡萄果實中不同部位白藜蘆醇含量由高到低的順序為果皮＞果籽，這與李婷等人的研究結果相一致。

圖4 水楊酸處理對蛇龍珠葡萄果皮（A）、果籽（B）C4H活性的影響

本實驗研究發現，果皮中白藜蘆醇含量的變化出現2個高峰，而在葡萄生長發育的過程中，果籽內白藜蘆醇含量僅出現1個高峰，即在果實膨大時期，之后一直處于下降趨勢，這可能與葡萄轉色有關；進一步從苯丙烷代謝途徑分析發現，果皮和果籽中PAL和C4H活性變化曲線也呈雙峰型變化，這與陳建業［17］的研究相一致。

研究還可以看出，果皮中的白藜蘆醇含量隨著果實生長發育過程呈現先增長后下降再增長的雙峰變化趨勢，且花后80 d其含量高于花后35 d。這是因為花后20 d果實處于綠果期，各種化合物正在緩慢地合成，白藜蘆醇含量也在緩慢地增加，花后35 d出現第一個高峰；而后果實開始膨大，需要消耗之前積累的化合物，因此白藜蘆醇含量有所下降；花后50 d，隨著果實進入糖分快速積累階段，白藜蘆醇含量先緩慢升高；花后65 d伴隨著果實轉色，此時果實中的白藜蘆醇含量快速升高；在花后80 d白藜蘆醇含量達到最高峰。隨著葡萄發育進入成熟階段白藜蘆醇含量逐漸下降，在盛花后95 d果皮中白藜蘆醇含量降到最低。

研究表明，白藜蘆醇在自然條件下合成較少，經外源刺激可以大量合成，因此可以采取人工誘導的方法來提高白藜蘆醇的含量。本研究表明，經不同濃度水楊酸處理蛇龍珠葡萄后，能夠明顯提高PAL和C4H的活性，因而進一步增加白藜蘆醇的含量，且誘導果皮和果籽白藜蘆醇含量較適的水楊酸濃度為50 mg/L和25 mg/L。

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中圖分類號：S663.1

文獻標識碼：A

DOI：10.13414/j.cnki.zwpp.2016.04.004

收稿日期：2016-05-04

基金項目：國家自然科學基金（31260456）

作者簡介：丁玲（1991-），女（回族），在讀碩士研究生，研究方向為葡萄栽培生理。E-mail: 1063059804@qq.com

*通訊作者：代紅軍（1967-），女（漢族），教授，碩士生導師，主要從事葡萄栽培生理研究。E-mail: dai_hj@nxu.edu.cn

Effects of salicylic acid on induction of resveratrol synthesis in Cabernet Gernischt grapes

DING Ling ， QIN Chenliang， DAI Hongjun*
（School of Agronomy， Ningxia Univercity； Engineering Research Center of Grape and Wine，Ministry of Education of China，Ningxia University， Yinchuan 750021）

Abstract:The different concentrations （0， 25， 50， 100 mg/L） of salicylic acid （SA） were conducted on the Cabernet Gernischt grapes during the beeries growth periods， the content of resveratrol of skins and seeds were determined to investigate the effects of salicylic acid on induction of resveratrol synthesis， and to discuss the relationship between resveratrol and the activities of phenylalanineammonia-lyase （PAL）， cinnamate-4-hydroxylase （C4H）in Cabernet Gernischt grapes.The results indicated that the content of resveratrol in the skins and seeds of the Cabernet Gernischt grapes had two peaks at 35 days and 80 days after anthesis.The activity of PAL and C4H were similar to the change of resveratrol content.There was an significant effects on Cabernet Gernischt with different concentration of SA treatments， among which 50 mg/L SA treatment had the best induction effect in the skins and 25 mg/L SA treatment had done best in the seeds.Therefore， the moderate concentration of SA treatment could induce the activity of PAL and C4H and further enhance the content of resveratrol.

Key words:salicylic acid； Cabernet Gernischt； resveratrol； PAL； C4H