惠州地區5 500例珠蛋白生成障礙性貧血的基因檢測分析*

劉宇鵬,李雪蓮,劉瑞玉

(1.南方醫科大學第二臨床醫學院,廣州 510515;2.廣東醫學院，廣東湛江 524001；3.廣東省惠州市中心人民醫院檢驗中心　516001)

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惠州地區5 500例珠蛋白生成障礙性貧血的基因檢測分析*

劉宇鵬1,李雪蓮2#,劉瑞玉3△

(1.南方醫科大學第二臨床醫學院,廣州 510515;2.廣東醫學院，廣東湛江 524001；3.廣東省惠州市中心人民醫院檢驗中心516001)

目的運用基因診斷技術檢測患者珠蛋白生成障礙性貧血(簡稱地貧)基因，了解主要的基因突變類型及其頻率。方法以2010年1月至2014年10月就診于惠州市中心人民醫院血液科(門診和體檢)的5 500例患者為研究對象，采用跨越斷裂點的PCR(GAP-PCR)技術及膜反向雜交技術分別對α-和β-地貧進行基因分析。結果檢出α-地貧基因改變1 604例，占29.16%；檢出β-地貧基因改變1 096例，占19.93% ，檢出αβ-復合型地貧患者119例。結論α-和β-地貧的基因篩查為婚育指導提供了有價值的基礎資料。

珠蛋白生成障礙性貧血；基因突變；基因檢測；基因頻率

珠蛋白生成障礙性貧血(thalassemia)，又稱地中海貧血(簡稱地貧)，是一種危害極大的常染色體隱性遺傳的血紅蛋白疾病。主要分為α-地貧和β-地貧，其發病機制是α-及β-珠蛋白基因的先天性缺陷，造成α-及β-珠蛋白肽鏈合成減少或缺失，從而引起血紅蛋白生成障礙，導致無效造血和溶血性貧血。地貧廣泛分布于全球各地，尤其是地中海地區，我國廣東、廣西、海南等地為高發區。重型α-地貧胎兒(Barts水腫)多在妊娠末期胎死腹中或產下便死亡。而血紅蛋白H病(HbH病)及重型β-地貧患兒一般在出生后4～6個月發病，呈進行性貧血，要靠輸血維持生命，易產生多種并發癥[1]。為了解廣惠州地區α-地貧和β-地貧的基因突變類型及其頻率分布，本研究對疑似地貧的5 500例患者進行α-和β-地貧的基因檢測診斷，現將檢測結果報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料以2010年1月至2014年10月于惠州市中心人民醫院血液科就診的患者(包括門診及住院)5 500例為研究對象,年齡14～90歲。

1.2儀器與試劑血紅蛋白電泳采用中壓電泳儀及其配套的GSG-2000核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統。采用跨越斷裂點PCR(又稱裂口PCR，GAP-PCR)技術檢測常見的3種缺失型α地貧基因(--SEA、-α3.7、-α4.2)，試劑盒由深圳益生堂生物企業有限公司提供；采用PCR探針法定性檢測人基因組DNA中的17種β-地貧基因，試劑盒由深圳益生堂生物企業有限公司提供。DNA擴增儀為美國ABI公司7500實時熒光定量PCR系統，所有操作嚴格按說明書進行。

1.3方法

1.3.1標本的采集及處理使用新采集的或-20 ℃存放1個月以內的枸櫞酸鈉或乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，不可用肝素抗凝全血。

1.3.2α-地貧基因檢測α-地貧采用GAP-PCR法檢測東南亞型缺失(--SEA)、右側缺失(-α3.7)和左側缺失(-α4.2)。從-20 ℃冷藏的試劑盒中取出PCR反應管，根據樣品DNA濃度加入待測DNA樣品溶液1～3 μL，不足部分補加滅菌雙蒸水，使總體積達到25 μL，蓋嚴管蓋，短暫離心。將擴增管直接插入PCR儀中，按95 ℃變性10 min；98 ℃ 45 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 180 s，35個循環；72 ℃延伸7 min，2～8 ℃保存或立即電泳。取PCR產物5～10 μL，依次加入1.2%的瓊脂糖凝膠加樣孔中。接通電源，調至穩壓5～8 V/cm，電泳約40 min，置于紫外凝膠透射成像儀上觀察，根據擴增產物長度得出診斷結果。電泳結果的判定：1.9、1.7、1.4、1.2 kb擴增帶分別對應α-珠蛋白基因右側缺失(-α3.7)、無缺失、左側缺失(-α4.2)，東南亞型缺失(--SEA)。

1.3.3β-地貧基因檢測β-地貧采用膜反向雜交技術檢測中國人常見的8個位點，即CD41-42(-TCTT)、ISV-2-654 C→T、CD17 A→T、-28 A→T、CD26 G→A、CD71-72(+A)、CD43 G→T、-29 A→G，以及9個少見位點突變，即起始密碼子ATG→AGG、CD14-15(+G)、CD27-28(+C)、-32 C→A、-30 T→C、IVS-1-1 G→T、IVS-1-5 G→C、CD31(-C)、CAP +40～+43(-AAAC)。取出試劑盒中的PCR擴增管，5 000 r/min離心數秒，分別加入45 μL PCR反應液，然后小心吸取3 μL待測DNA樣品溶液置于PCR擴增管中，混勻，5 000 r/min離心數秒。將擴增管直接插入PCR儀中95 ℃變性5 min；94 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃延伸5 min，當天檢測或置于-20 ℃存放1周內使用。PCR產物與試劑盒配置的含探針的膜條置于43 ℃雜交儀進行反向點雜交過夜，次日取出進行洗膜和顯色。根據膜上出現的藍色斑點判斷β-珠蛋白基因相應位點是否有突變，并判斷突變為雜合子或純合子。

1.4統計學處理采用SPSS18.0統計軟件進行數據處理，計數資料以例數或百分率表示。

2　結　果

2.1α-和β-地貧基因改變的檢出率在進行地貧基因檢查的5 500例患者中，α-珠蛋白基因改變1 604例，占29.16%；β-珠蛋白基因改變1 096例，占19.93%。

2.2α-地貧基因檢測情況檢測出α-珠蛋白基因缺失1 367例，其中東南亞型地貧1 249例，基因診斷為--SEA/αα；HbH病83例，基因診斷為--SEA/-α3.764例、--SEA/-α4.219例；靜止型α-地貧256例，基因診斷為-α3.7/αα 195例、-α4.2./αα 61例；純合子12例，基因診斷為-α3.7/-α3.710例、-α4.2./-α4.22例；雙重雜合子4例，基因診斷均為-α4.2/-α3.7。見表1。

表1　α-地貧患者的基因類型及其構成比

2.3β-地貧基因檢測情況檢測出β-珠蛋白基因突變類型27種，共1 096例，分為雜合子、雙重純合子和雙重雜合子。其中雜合子1 064例，占19.35%(1 064/5 500)，基因診斷為CD41-42位突變447例、ISV-2-654位突變332例、CD17位突變104例、-28位突變81例、βE位突變30例、CD71-72位突變19例、CD14-15位突變19例、CD27/28位突變19例、IVS1-1位點突變位突變8例、CD43位突變6例、βCAP位點突變3例、CD17-18位突變1例。雙重純合子共10例，占0.18%(10/5 500)，基因診斷為-28/-28(5例)、CD17/17(2例)、ISV-2-654/ISV-2-654(3例)。雙重雜合子共22例，占0.40%(22/5 500)，基因診斷為CD-28/ISV-2-654(4例)、ISV-2-654/-28(3例)、ISV-2-654/βE(2例)、CD71-72/17(2例)、CD41-42/βE(2例)、-28/CD17(2例)、CD17/41-42(2例)、CD17/βE(1例)、CD43/17(1例)、ISV-2-654/14-15(1例)、IVS1-1/ISV-2-654(1例)、βE/ISV-2-654(1例)。見表2。

表2　β-地貧患者的基因類型及其構成比

2.4αβ-復合型地貧基因檢測情況檢出αβ-復合型地貧119例，主要的復合類型為：東南亞型地貧合并CD41-42位單基因突變(27例)、靜止型地貧合并CD41-42位單基因突變(18例)、東南亞型地貧合并ISV-2-654位單基因突變(16例)、靜止型地貧合并-28位單基因突變(13例)。見表3。

表3　β地貧復合α地貧基因型分布[n(%)]

3　討　論

地貧是我國長江以南各省發病率最高、影響最大的一類血紅蛋白病，其中尤以廣西、廣東和海南三省(區)為甚，廣東省發病率為8%～10%，廣西和海南更高[2]。健康成人血紅蛋白中的珠蛋白由4條肽鏈組成，包括α、β、γ、δ珠蛋白肽鏈，分別由相應的基因編碼，這些基因的缺失或點突變可造成各種肽鏈的合成障礙，致使血紅蛋白的組分改變。地貧就是由珠蛋白基因的缺失或點突變導致，通常分為α、β、γ和δ 4種類型，以β-和α-地貧較為常見。α-地貧分為最輕、輕、中間及重型；β-地貧分為輕、中、重型[3]。地貧是最為常見的單基因遺傳病，主要表現為慢性溶血性貧血，重型患者胎死宮內或生后依賴輸血生存且絕大部分在幼年期夭折。中間型地貧有明顯的遺傳異質性，臨床表型變化大，大多數患者的生存質量會受影響，需要偶爾或不定期的輸血治療，患兒生長發育也會受到嚴重影響[4-5]。

采用GAP-PCR技術檢測α-地貧在中國人群中最為常見的3種缺失類型，檢出α-地貧陽性者1 604例，占29.16%。其中陽性率最高的3種類型分別為東南亞型缺失(--SEA)、右側缺失(-α3.7)和左側缺失(-α4.2)，共1 505例，占總α-地貧陽性者的93.83%(1 505/1 604)。僅東南亞缺失型(--SEA) 就檢出1 249例,占總α-地貧陽性者的77.87%(1 249/1 604)，提示本地區α-地貧基因型以東南亞缺失型為主，與同類研究結果吻合[6-7]。

采用PCR膜反向點雜交技術檢測β-地貧的17種基因位點突變，本研究中檢出β-地貧陽性者1 096例，占19.93%。其中CD41-42、IVS-2-654、CD17、-28和CD71-72是中國人常見類型，共983例，占總β-地貧陽性者的89.69%(983/1 096)。以CD41-42突變頻率最高,占總β-地貧陽性者的40.78%(447/1 096)，其次是IVS-2-654(30.29%)、CD17(9.48%)和-28(7.39%)，與廣東地區同類研究結果基本吻合[8-9]。

共檢測出αβ-復合型地貧患者119例，檢出率為2.16%。在α-和β-地貧雙重雜合子時α-地貧特征通常被掩蓋，臨床表型多呈現β-地貧特征，因此臨床常診斷為β-地貧。地貧是一種遺傳性溶血性貧血，大部分中間型和所有重型地貧患者需要靠輸血維持生命，在精神上和經濟上給社會及家庭帶來極大的負擔。夫婦雙方都帶有地貧基因，即兩人都是輕型地貧，其子女則有25%的可能性是重型地貧，50%的可能是輕型地貧，只有25%的可能是正常；如果只有一方是輕型地貧患者，其子女有50%的可能為正常，50%的可能為輕型地貧，不會出現重型地貧，對于一方已確診攜帶有標準型(-SEA/aa)或β-地貧基因的夫婦，另一方必須進行地貧基因檢測，以防止中重型地貧患兒出生,從而達到優生、優育，提升人口素質的目的。本研究為惠州地區更好地開展地貧的診斷、遺傳咨詢和產前診斷提供了客觀依據。

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Analysis on gene detection in 5 500 cases of thalassemia in Huizhou region*

LiuYupeng1,LiXuelian2,LiuRuiyu3△

(1.SecondClinicalMedicalCollegeofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China;2.GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang,Guangdong524001,China;3.ClinicalLaboratoryCenter,HuizhouMunicipalCentralPeople′sHospital,Huizhou,Guangdong516001,China)

ObjectiveTo use the genetic diagnosis technique to perform the gene detection in the patients with thalassemia for understanding the main gene mutation types and their gene frequencies.MethodsTotally 5 500 outpatients and individuals undergoing physical examination in the hematology department of the Huizhou Municipal Central People′s Hospital from January 2010 to October 2014 were taken as the research subjects.The GAP-PCR and membrane reverse hypridition technology were adopted to conduct the gene analysis of α- and β- thalassemia.ResultsA total of 1 604 cases of α-globin gene change were detected,accounting for 29.16% of the total detected subjects;1 096 cases of β-globin gene change were detected,accounting for 19.93% of the total detected subjects;119 cases of αβ-complex thalassemia were detected.ConclusionThe gene screening of α- and β- thalassemia provides the valuable basic data for conducting the marital and fertility instructions.

thalassemia；gene mutation；genetic testing；gene frequency

論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.19.014

廣東省惠州市科技計劃項目(2014y015)。△#共同為第一作者。△

,E-mail:liuruiyu301@163.com。

劉宇鵬(1993-)，在讀本科，主要從事臨床醫學方面的研究。

R556

A

1671-8348(2016)19-2635-03

2016-01-08

2016-03-20)