載體濃度和感受態對大分子載體轉化效率的影響

覃鴻妮， 張蘭蘭

(1.蘇州工業園區服務外包職業學院,江蘇蘇州 215123；2.金唯智(蘇州)生物科技有限公司，江蘇蘇州 215123)

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載體濃度和感受態對大分子載體轉化效率的影響

覃鴻妮1， 張蘭蘭2

(1.蘇州工業園區服務外包職業學院,江蘇蘇州 215123；2.金唯智(蘇州)生物科技有限公司，江蘇蘇州 215123)

[目的]研究載體量和感受態對陽性克隆率的影響。[方法]利用引物拼接PCR技術，自行設計26條引物合成一個835 bp的目的基因，將該基因與約20 kb的大分子載體連接構成重組質粒。在1 500 ng目的基因底物量的基礎上，設置50、100、150、200、250、300 ng 6個梯度載體量，得到的重組反應產物再轉化入Top10F′、DH5α、Stbl3、Epi400、JM108、SCSI 6種不同的感受態中， 組成36個試驗組合。[結果] 不同載體量陽性克隆率由大到小依次為200、250、300、150、100、50 ng，200 ng的陽性克隆率最高可達75%，平均達28.5%。不同感受態細胞陽性克隆率由大到小依次為Stbl3、Top10F′、DH5α、JM108、Epi400、SCSI，Stbl3在任何載體濃度下均高于其他感受態，平均陽性克隆率為42.4%。[結論]載體量和感受態均明顯影響陽性克隆率，最佳組合為200 ng的載體分子量配合Stbl3感受態，陽性克隆率可達75%。

大分子載體；載體濃度；感受態； 轉化效率

質粒載體是細胞中具有自主復制能力的較小DNA分子，是基因工程中重組DNA 最常見的運載體，可以將目的DNA片段通過重組DNA技術，導入受體細胞中進行繁殖和表達[1-7]。質粒載體的DNA長度從數千堿基對到數十萬堿基對不等，相對于分子量較小的載體，大分子載體在細胞外的重組連接效率低，在感受態中轉化效率低，在宿主細胞內的拷貝率低，傳代易產生目的DNA的隨機突變和缺失，表達很不穩定[8-10]。因此需要有一個優化的重組連接體系和一個優化的感受態轉化體系，提高大分子載體的重組效率和轉化效率[11-13]。筆者利用引物拼接PCR(Polymerase Chain Reaction)技術，自行設計26條引物合成一個835 bp的目的基因，將該基因與約20 kb的大分子載體pCMV5連接構成重組質粒。在1 500 ng目的基因底物量的基礎上，以50、100、150、200、250、300 ng進行6個梯度載體量的重組反應，得到的重組反應產物再轉化入Top10F′、DH5α、Stbl3、Epi400、JM108、SCSI 6種不同感受態中，交叉組成36種不同的組合，分別對這36種組合所得到的陽性克隆率進行分析，以期得到針對大分子載體進行重組克隆的最優載體量和最佳感受態。

1　材料與方法

1.1試驗材料1.1.1目的基因。選定一個長835 bp的目的基因(圖1)，整體GC含量為56.17%，非高GC含量基因，且GC含量波動較小，總體較易擴增(圖2)。目的基因無明顯正向重復，無明顯反向重復，無明顯自身重復，引物設計無難度，PCR擴增較易。1.1.2目標載體。目標載體為經人工改造的pCMV5載體，人工加入AMP抗性，載體總長19 043 bp，屬于大分子質粒載體(圖3)。1.2試驗方法

1.2.1目的基因的合成。根據基因序列委托相關公司設計和合成PCR擴增所需的26條引物(表1)，將引物稀釋到20 pmol/μL，每條引物取2 μL混勻作為引物混液，通過2輪PCR合成目的基因。1.2.2不同載體量設置。取36個分別裝有10 μL重組酶的PCR管，分成A、B、C、D、E、F 6組，每組6個，分別編號A1～A6，B1～B6，C1～C6，D1～D6，E1～E6，F1～F6，并按表2(以A組為例)加入不同的載體量。PCR儀50 ℃反應1 h，-20 ℃保存。

1.2.3不同感受態設置。Top10F′感受態包括A1～A6，DH5α感受態包括B1～B5，Stb13感受態包括C1～C6，Epi400感受態包括D1～D6，JM108感受態包括E1～E6，SCSI感受態包括F1～F6。

1.2.4菌檢結果判定。36個平板，每個平板挑選24個斑進行電泳檢測，由于電泳樣品太多，在結果中不直接顯示電泳圖，而是統計出每24個克隆中陽性克隆的個數除以24，得到陽性克隆率。菌檢產物陽性克隆的判斷方法：將電泳條帶與Ladder比對，1 149 bp即陽性克隆記為1，412 bp即空載體記為0，引物二聚體即該菌液樣品是雜斑生長記為0。

圖1　目的基因全序列Fig. 1　Sequence of objective gene

圖2　目的基因GC含量Fig. 2　GC ratio of objective gene

圖3　目標載體結構Fig. 3　Analysis of vector structure

序號Code序列Sequence(5'-3')堿基數Basenumber1GGGGCTGCTGACCTGGCTCATGTCCATCGATGTCAAGTACCAGATCTGGAAG522GAACGAGTTGTCCGTGAAGATGACCCCGAACTTCCAGATCTGGTACTTGACATC543TCTTCACGGACAACTCGTTCCTGTACCTGGGCTGGTACATGGTGATGTCC504CGGCAAAGAAGAAGTTGTTGTAGTGGCCCAGGAGGGACATCACCATGTACCAGC545CAACAACTTCTTCTTTGCCGCCCACCTGCTGGACATCGCCATGGGGGTCAAGA536TTGTGGGTGACAGAGGAGAGGATGGTACGCAGCGTCTTGACCCCCATGGC507CTCTCCTCTGTCACCCACAATGGGAAACAGCTGGTGATGACTGTGGGCCTCCT538AAGGCCACCACAGTGTACAGGTAGACCACGACGGCCAGGAGGCCCACAGTCATC549CTGTACACTGTGGTGGCCTTCAACTTCTTCCGCAAGTTCTACAACAAGAGCGA5310GCACTTCATGTCCGGCTCGTCCTCGTCCTCGCTCTTGTTGTAGAACTTGC5011AGCCGGACATGAAGTGCGATGACATGATGACGTGCTACCTGTTCCACATGTACGT5512TCGTCCCCGATGCCTCCGCCAGCCCGGACGCCCACGTACATGTGGAACAGGTAGC5513GGCATCGGGGACGAGATCGAGGACCCAGCGGGCGATGAATACGAGCTCTAC5114AAGAAGAAGGTGATGTCGAAGACCACCCGGTAGAGCTCGTATTCATCGCC5015GTCTTCGACATCACCTTCTTCTTCTTCGTCATTGTCATCCTGCTGGCCATC5116GGAGCTCGCCGAAGGCGGCGATAATCAGACCCTGGATGATGGCCAGCAGGATGA5417CCTTCGGCGAGCTCCGAGACCAGCAGGAGCAAGTGAAGGAAGATATGGAG5018CTGCCAATCCCGCAGATGAAGCATTTGGTCTCCATATCTTCCTTCACTTGCT5219CTGCGGGATTGGCAGTGACTACTTCGATACCACGCCGCACGGCTTCGAGACCC5320CATGTAATTGGCCAGATTGTGCTCCTCTAGCGTGTGGGTCTCGAAGCCGTG5121CACAATCTGGCCAATTACATGTTCTTCTTGATGTATCTGATAAACAAGGAC5122ACTCCTGGCCCGTGTGCTCCGTCTCGTCCTTGTTTATCAGATACATCAAGAA5223CACACGGGCCAGGAGTCCTACGTCTGGAAGATGTATCAGGAGAGGTGCTGGG5224ACTGCTTGCGGAAGCAGTCGCCGGCGGGGAAGAAGTCCCAGCACCTCTCCTGATA5525CTGCTTCCGCAAGCAGTACGAGGACCAGCTGAGCTGAGAAGCTTGCATGCCTGCA5526GTCACAGGGATGCCACCCGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT55

表2　連接體系

2　結果與分析

2.1目的基因的合成由圖4可知，目的基因的PCR產物在750～1 000 bp，與其理論值大小855 bp相符。

圖4　PCR產物電泳圖Fig. 4　Electrophoretogram of PCR products

2.2載體線性化由圖5可知，酶切后理論大小為19 043和98 bp，由于5 000 Ladder最小值為100 bp，因此,98 bp在圖中無法顯示，酶切結果與理論值相符。

2.3轉化后菌落生長情況在6種感受態中，A1～F6共36個平板，分別為加入載體量50、100、150、200、250、300 ng的菌落生長情況。由圖6～10可知，36個平板菌落均生長良好。

注：1、2、3分別為5 000 bp Ladder、酶切樣品、10 kb Ladder。Note:1,2,3 bands were 5 000 bp Ladder,enzyme digestion sample and 10 kb Ladder,respectively.圖5　載體酶切電泳圖Fig.5　Electrophoretogram of restriction enzyme digestion products

2.4菌檢陽性克隆率由表4和圖12可知，不同載體濃度對大分子載體的陽性克隆率有明顯影響，平均陽性克隆率由大到小依次為200、250、300、150、100、50 ng，在所有感受態中，200 ng的陽性克隆率均最大，最高可達75%，平均達28.5%。載體濃度低于100 ng轉化效率不到10%。

不同感受態對大分子載體的陽性克隆率有明顯影響，平均陽性克隆率由大到小依次為Stbl3、Top10F′、DH5α、JM108、Epi400、SCSI，最好的感受態是Stbl3，在任何載體濃度下均高于其他感受態，平均陽性克隆率為42.4%。JM108、Epi400、SCSI 3種感受態的平均陽性克隆率均低于10%。

圖6　Top10F′ 感受態菌落生長情況Fig. 6　The growth of colonies cultured in Top10F′

圖7　DH5α感受態菌落生長情況Fig. 7　The growth of colonies cultured in DH5α

圖8　Stbl3 感受態菌落生長情況Fig. 8　The growth of colonies cultured in Stbl3

圖9　Epi400 感受態菌落生長情況Fig. 9　The growth of colonies cultured in Epi400

圖10　JM108 感受態菌落生長情況Fig. 10　The growth of colonies cultured in JM108

圖11　Scsi感受態菌落生長情況Fig. 11　The growth of colonies cultured in Scsi

%

3　討論

對于一般的重組試驗，載體加樣量遠低于200 ng，以最為普通的puc57系列載體為例，重組反應的載體加樣量僅30 ng左右[1，3-4]。這就導致實驗室在遇到較大的載體時，陽性克隆率低甚至為0的現象。不同感受態由于基因型的不同，對不同大小、不同類型質粒的拷貝率相差較大[14-18]。該研究選用的載體接近20 kb，較常用的3～4 kb的載體更有克隆難度。大分子載體由于具有重組效率低、轉化效率低、拷貝率低、表達不穩定、不易提取、分離純化困難等特點[8-10]，國內很多DNA服務公司都不愿意接受大分子載體的克隆，即使有相應的服務，由于失敗率高，試驗成本高，服務相應的價格也很高。該研究以約20kb的載體為例，選取6個梯度的載體量和6種不同的感受態進行試驗，結果表明，載體量和感受態對陽性克隆率均有很大影響，并得到了最優組合，為提高大分子載體的克隆效率提供參考和借鑒。

4　結論

該研究針對約20 kb的大分子載體，在1 500 ng目的基因底物量的基礎上，設置50、100、150、200、250、300 ng 6個梯度載體量，得到的重組反應產物再轉化入Top10F′、DH5α、Stbl3、Epi400、JM108、SCSI 6種不同感受態中， 組成36個試驗組合。結果表明，載體量和感受態均明顯影響陽性克隆率。

當反應體系中的載體量過低時，重組反應無法得到足夠多的陽性克隆，篩選效率很低。當反應體系的載體量過高時，挑斑篩選時又會篩選到較多的空載體，影響陽性克隆率。針對20 kb左右的載體，載體的分子量在200 ng左右陽性克隆率最高。相對于其他感受態，Stbl3對于大載體的拷貝能力遠高于其他感受態。最佳組合為200 ng的載體分子量配合Stbl3感受態，陽性克隆率可達75.0%。

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Effects of Vector Density and Competent Cells on the Large Vector Transformation Efficiency

QIN Hong-ni1, ZHANG Lan-lan2

(1.Suzhou Industrial Park Institute of Services Outsourcing, Suzhou, Jiangsu 215123; 2.Genewiz (Suzhou) Biotechnology Co.,Ltd.,Suzhou, Jiangsu 215123)

[Objective] To research the effects of vector quantity and competence on the positive cloning rate. [Method] With a known gene sequence but in the absence of DNA template, we artificially designed 26 primers to synthesize a target gene of 835 bpinvitrousing overlapping PCR technique. The whole experiment design with two factors and six levels (36 combinations) was applied to study the effects of the vector density and competent cells on the large vector transformation efficiency. Based on the 1 500 ng target gene, the vector density grades were designed (50, 100, 150, 200, 250,300 ng), and then the recombinant plasmids were transformed into Top10F’, DH5α, Stbl3, Epi400, JM108, SCSI. [Result] The positive cloning rates of different vector amounts from big to small were in the order of 200, 250, 300, 150, 100 and 50 ng. The maximum positive cloning rate of 200 ng reached 75%; and the average value was 28.5%. The positive cloning rates of different competent cells from big to small were in the order of stbl3, Top10F′, DH5α, JM108, Epi400 and SCSI. Stbl3 was higher than other competent cells under any vector density. And its average positive cloning rate was 42.4%.[Conclusion] Both the vector density and competent cells have significant effects on the large vector transformation efficiency. The optimal combination is C4 with 200 ng vector density and Stbl3, the positive cloning rate of which could reach 75%.

MacromoIecular vector; Vector density; Competent cells; Transformation efficiency

A

0517-6611(2016)17-181-06

蘇州工業園區服務外包職業學院教研教改研究課題(JG-201601)。

覃鴻妮(1983- )，女，湖北長陽人，講師，博士，從事分子生物學研究。

2016-05-06

Q 81