發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類含量測定的方法學(xué)研究

劉春雨，王集會

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心，山東濟(jì)南 250355)

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發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類含量測定的方法學(xué)研究

劉春雨1，王集會2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心，山東濟(jì)南 250355)

[目的]建立紫外可見分光光度法測定發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類化合物含量的方法。[方法]通過醇水提取發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類化合物，在510 nm下測定其吸光度并計算其含量。[結(jié)果]黃酮類化合物濃度在0.02～0.10 mg/mL時，其濃度與對應(yīng)的吸光度呈良好的線性關(guān)系；在精密度試驗中，發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類化合物的平均吸光度為0.420 5，RSD=0.740 7%；在重現(xiàn)性試驗中，發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類化合物的平均質(zhì)量比為9.091 mg/g，RSD=2.007%；在加樣回收率試驗中，其平均回收率為97.92%，RSD=1.568%。[結(jié)論]采用紫外可見分光光度法對發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類化合物含量進(jìn)行測定，其精密度、重現(xiàn)性、回收率均良好，可用來測定發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類化合物的含量。

發(fā)酵蜈蚣粉；總黃酮；紫外可見分光光度法；方法學(xué)

蜈蚣為蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)的干燥體，其辛味，性溫，有毒[1]。蜈蚣作為傳統(tǒng)中藥材，具有息風(fēng)止痙、解毒散結(jié)、通絡(luò)止痛的作用[2]，臨床常用于治療腫瘤、原發(fā)性高血壓、糖尿病及并發(fā)癥、神經(jīng)性頭痛、偏頭痛等[3-4]。而黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化壓力和促進(jìn)抑癌基因表達(dá)的作用[5]，因而成為人們研究的熱點。通過使用球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill)對蜈蚣進(jìn)行發(fā)酵可以提高蜈蚣中黃酮類物質(zhì)的含量，增強(qiáng)其解毒散結(jié)的功效，還可以較大幅度地改變藥性、提高療效、降低毒副作用[6]。筆者通過紫外可見分光光度法對發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮類化合物含量進(jìn)行測定，并對其方法學(xué)進(jìn)行考察，旨在為今后發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類化合物藥理活性研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1儀器。UV9100B型紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)，KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，ST 16R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，F(xiàn)A1004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，SK-1快速混勻漩渦器(中國深圳)，遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱(上海陽光實驗儀器有限公司)，梅特勒—托利多分析天平(上海先悅機(jī)電有限公司)。

1.1.2試劑。蘆丁對照品(中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司)；乙醇、亞硝酸鈉、六水氯化鋁、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.1.3供試品。蜈蚣粉購自安徽亳州市(批號：20150730)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高德民副教授鑒定為少棘巨蜈蚣粉(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)。發(fā)酵蜈蚣粉(批號：20150801)由山東中醫(yī)藥大學(xué)化學(xué)實驗室自制。

1.2試驗方法

1.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。精密稱取蘆丁對照品20 mg，用60%乙醇溶解后，移入100 mL容量瓶定容至刻度線，搖勻，即得濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2發(fā)酵蜈蚣粉的制備。 稱取適量滅菌后的少棘巨蜈蚣粉，加入活的白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill)孢子粉混懸液(100億/g，山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所自篩菌株——桃5)，再加入適量吐溫-80助溶，用適量滅菌水將其稀釋為含1×108個孢子的混懸液，拌勻濕潤，在溫度25～28 ℃、濕度95%的條件下，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d左右，待長滿菌絲后停止發(fā)酵。

1.2.3蜈蚣粉醇提液的制備。 精密稱取發(fā)酵蜈蚣粉1 g(料液比為1∶30)，加入30 mL 80%乙醇，超聲20 min，于100 ℃下回流2.5 h，進(jìn)行抽濾，取上清液于8 000 r/min離心20 min，收集上清液于50 mL容量瓶中定容，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4紫外可見分光光度法測定發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類化合物。

1.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別精密量取“1.2.1”的標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL試管中，先加30%乙醇至5 mL，再加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL；搖勻后靜置6 min；然后加10%六水氯化鋁0.6 mL，搖勻后靜置5 min；最后加入1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，并用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻后于510 nm處測定其吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2精密度試驗。精密稱取發(fā)酵蜈蚣粉2 g，按“1.2.3”的方法提取試樣液并吸取此試樣液，重復(fù)取樣5次，每次2 mL，分別用紫外可見分光光度法在波長510 nm下測定其總黃酮類化合物的吸光度，方法同“1.2.4.1”，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)誤差RSD。

1.2.4.3重現(xiàn)性試驗。精密稱取發(fā)酵蜈蚣粉2 g，共5份，按“1.2.3”的方法提取試樣液并吸取此試樣液，在波長510 nm下測定其總黃酮類化合物的吸光度，方法同“1.2.4.1”，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其總黃酮類化合物含量及相對標(biāo)準(zhǔn)誤差RSD。

1.2.4.4加樣回收率試驗。精密稱取總黃酮類化合物含量為9.090 6 mg/g的發(fā)酵蜈蚣粉約2 g，共5份，分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.3”的方法提取試樣液并吸取此試樣液，在波長510 nm下測定其加樣后總黃酮類化合物的吸光度，方法同“1.2.4.1”，計算總黃酮類化合物的含量，加樣回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)誤差RSD。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.134 9x+0.007，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。表明蘆丁濃度在0.02～0.10 mg/mL時，其濃度與對應(yīng)的吸光度呈良好的線性關(guān)系，符合Lambert-Beer定律，可用此計算發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類化合物的含量。

2.2精密度由表1可知，平均吸光度為0.420 5，相對標(biāo)準(zhǔn)誤差RSD=0.740 7%，符合RSD≤5%的要求，說明該方法精密度良好。

表1　精密度

2.3重現(xiàn)性由表2可知，平均質(zhì)量比為9.091 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)誤差RSD=2.007%，符合RSD≤5%的要求，說明該方法重現(xiàn)性良好。

表2　重現(xiàn)性

2.4加樣回收率由表3可知，平均回收率為98.92%，符合回收率在95%～105%的要求，相對標(biāo)準(zhǔn)誤差RSD=1.568%，符合RSD≤5%的要求，說明回收率較高。因此，該方法可用來測定發(fā)酵蜈蚣粉中黃酮類化合物的含量。

表3　加樣回收率

3　結(jié)論與討論

該試驗采取的紫外可見分光光度法具有設(shè)備簡單、適用性廣、準(zhǔn)確度和精密度較高的特點，在中藥總黃酮含量分析中發(fā)揮重要作用[7]。因此，該試驗對發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類化合物采用紫外可見分光光度法進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該方法精密度、重現(xiàn)性及回收率均在要求范圍之內(nèi)，可作為測定發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類化合物的有效方法，旨在為今后發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類化合物藥理活性研究提供理論依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部(2010年)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版版，2010：335-336.

[2] 王賢純.蜈蚣的藥用研究進(jìn)展[J].動物學(xué)雜志，2002，37(3)：88-91.

[3] 張艷，劉西建.抗腫瘤的有毒中藥現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2012(24)：154-158.

[4] 張敬，洪月光，瞿鑫宏.久香巖痛寧鎮(zhèn)痛作用的實驗研究[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報，2001，16(2)：33-34.

[5] 黃華藝，查錫良.黃酮類化合物抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].中國新藥與臨床雜志，2002，21(7)：428-433.

[6] 王延年，董雪，喬延江，等.中藥發(fā)酵研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化)，2010，12(3)：437-440.

[7] 馬陶陶，張群林，李俊.中藥總黃酮的含量測定方法[J].安徽醫(yī)藥，2007，11(11)：1030-1032.

The Methodology for Determination of Total Flavonoids Content in Fermented Centipede Powder

LIU Chun-yu1, WANG Ji-hui2*

(1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan, Shandong 250355; 2. Experimental Centre, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan, Shandong 250355)

[Objective] To establish a method that using UV-VIS spectrophotometry to determine total flavonoids content in fermented centipede powder. [Method] Through the aqueous alcohol extracting from fermented centipede powder, the absorbances at 510 nm of total flavonoids were determined and contents were calculated. [Result] Concentration of flavonoids, within the scope of 0.02 to 0.10 mg/ml, its concentration and the corresponding absorbance showed good linear relationship; in the precision test of determination of total flavonoids in fermentation centipede powder, the average absorbance was 0.420 5,RSD= 0.740 7%; in the reproducibility experiment, the average quality was 9.091 mg/g,RSD=2.007%. In the sample recovery rate test of determination, its average recovery was 97.92%,RSD=1.568%. [Conclusion] By UV-VIS spectrophotometry for determination of total flavonoids content in fermented centipede powder, its precision, repeatability and recovery rate are good. So the method can be used to determine the flavonoids in fermented centipede powder.

Fermented centipede powder; Total flavonoids; UV-VIS spectrophotometry; Methodology

山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練(SRT)計劃資助項目(2015308)。

劉春雨(1995- )，女，山東濟(jì)南人，本科生，專業(yè)：制藥工程。*通訊作者，副教授，從事蟲類中藥發(fā)酵及活性成分研究。

2016-05-10

S 865.4+9

A

0517-6611(2016)17-154-02