養殖大菱鲆腸炎病的流行病學和病原學研究

姜 燕， 崔曉翠， 張 正， 景亞運， 王印庚，吳立新，常亞青

(1. 大連海洋大學水產與生命學院,遼寧大連 116023；2. 中國水產科學院黃海水產研究所，山東青島 266071)

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養殖大菱鲆腸炎病的流行病學和病原學研究

姜 燕1， 崔曉翠1， 張 正2*， 景亞運1， 王印庚2，吳立新1，常亞青1

(1. 大連海洋大學水產與生命學院,遼寧大連 116023；2. 中國水產科學院黃海水產研究所，山東青島 266071)

[目的]腸炎病是目前大菱鲆養殖行業中比較常見的疾病之一，該病感染率高，傳播迅速。[方法]從山東半島3個不同的養殖廠腸炎病發病大菱鲆體內分離致病菌，對其進行了常規生理生化特征測試和16SrRNA基因序列對比研究。[結果]從發病大麥鲆體內共分離到了株優勢細菌。理化特征分析結果顯示這3株菌中有2株分別與溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)表型特征非常相似，另1株細菌被證實為非弧菌屬的細菌，具體定種尚需進一步研究。分析這2株弧菌屬細菌的16SrRNA基因序列并構建了系統發育樹，結果表明這些菌株與溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的親緣關系最近。[結論]從發病大菱鲆體內分離菌株的2株細菌被鑒定為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)。

大菱鲆；腸炎病；16SrRNA；溶藻弧菌；大菱鲆弧菌

大菱鲆(Scophthalmus maximusL)隸屬鲆科菱鲆屬，分布于歐洲沿岸各主要海區，是歐洲水產品市場廣受歡迎的一種名貴魚種，具有較高經濟價值。我國國內的大菱鲆商業養殖始于1997年。近幾年由于養殖規模的不斷擴大，疾病的暴發也越來越頻繁。每年我國的養殖大菱鲆因疾病的損失就達4億～5億元[1]。丁春林等[2]對養殖大菱鲆進行了系統流行病學調查，發現腸炎病是養殖大菱鲆較為常見的疾病之一。筆者從山東半島不同的養殖廠采集發病大菱鲆的樣品，并進行細菌分離和系統病原鑒定研究。

1　材料與方法

1.1病魚樣品的采集從山東半島3個不同的養殖廠采集到患腸炎病的大菱鲆樣品，分別來自萊州市、青島市流亭鎮和榮成市。這3個病魚樣品的腸壁都可見明顯充血，且呈紅色，腸道中淤積了大量的黃白色糞便和黏液。

1.2菌種的采集分離及培養基無菌挑取病魚腸道中的白色糞便和黏液接種于鹽度3%的TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)平板培養基上，28 ℃下培養24～30h后，挑取優勢菌的單個菌落純化2遍后，置于20%甘油中-80 ℃冰箱下保存。

1.3形態觀察和生理生化試驗使用NikionE800光學顯微鏡觀察細菌個體形態、大小和鞭毛，用半固體培養基穿刺接種培養和水浸片結合觀察細菌運動性。參照伯杰氏細菌手冊(第9版)對細菌進行常規分類[3]，使用API20E試劑條(法國生物梅里埃公司)結合菌種鑒定管(北京陸橋公司)進行常見碳氮源利用和酶反應的測定，對于一些特征性反應則手工配制相應培養基進行。

1.416SrRNA序列測定與分析

1.4.1PCR模板的制備。將細菌接種在TSB平板上，28 ℃下培養24h。取單一菌落懸浮于無菌去離子水中，100 ℃ 水浴5～10min后，4 ℃下12 000r/min離心10min，上清液即為PCR擴增反應的模板。

1.4.216SrRNA基因序列的PCR擴增和序列測定。16SrRNA基因擴增的正向引物P27f，5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’，反向引物P1429r，5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’(此引物為細菌16SrRNA基因序列擴增的通用引物)。PCR反應體系(100μL)：1×PCR緩沖液、1.5mmol/LMgCl2、4×dNTP混合物125μmol/mL、引物各7.5nmol/mL、TaqDNA聚合酶1μL(5U/μL)、1μLDNA原液。PCR反應條件如下：94 ℃預變性4min；94 ℃變性30s，55 ℃復性30s，72 ℃延伸100s，35個循環；最后72 ℃溫育15min。最后，對PCR產物進行測序。

1.4.3序列分析和系統發育樹的構建。將所獲得的3株菌的16SrRNA基因序列使用BIOEDIT軟件進行對比分析，確定其相似性。從GenBank數據庫中選取與他們相似率最高的細菌16SrRNA基因序列，使用BIOEDIT軟件中集成的ClustalW軟件進行多序列匹配排列，使用系統發生推斷軟件包PHYLIP3.6a3進行統計和聚類分析。采用鄰位相連法(Neighbor-joining)進行發育系統樹分析，通過自舉分析(Bootstraping)進行系統進化樹評估，自舉數據集為1 000次[4]。

1.4.4通過系統發育樹構建16SrRNA基因序列來源。從GenBank數據庫中選取25株與所分析的細菌16SrRNA基因序列相似性較高的已知種菌株，與分離到的菌株共同構建系統發育樹。所選取菌株的相關數據和基因編號見表1。

表1　構建系統發育樹的16S rRNA基因序列及其數據庫編號

2　結果與分析

2.1流行病學特征腸炎病患病魚病征主要表現為停止攝食或吃食后再吐出，腸道中沒有食物，但有大量的黏性柱狀白色物質。病情嚴重者，腹部扁平、下陷，整個內臟團萎縮，肝臟大量出血，體色逐漸變淡(圖1)。該病在苗期和養成期均較常見，尤其多見于養成期，親魚期很少見到。此病的危害性較大，整池感染率可達90%以上，病魚表現為慢性死亡，日死亡率均為7%～8%。

圖1　大菱鲆腸炎病的外觀癥狀Fig. 1　External appearance of S. maximus with enteritis disease

2.2細菌的形態特征及運動性從這3個病魚樣品中分別分離到1株優勢細菌，將其分別編號為菌株Ⅳ、菌株Ⅴ和菌株Ⅵ。這3株菌在鹽度3%的TSB下培養基上28 ℃培養24～30h后，其中菌株Ⅳ和菌株Ⅵ形成的單個菌落均很小、透明、接近無色，菌株Ⅴ形成的單個菌落較大、呈彌散性分布。3株細菌的革蘭氏染色結果全部呈陰性，短桿狀。水浸片顯微檢查和半固體瓊脂穿刺接種培養都未發現這3株菌有明顯的運動性。在TCBS瓊脂平板培養基上，菌株Ⅳ能生長但菌落不呈黃色，菌株Ⅴ和菌株Ⅵ都呈明顯黃色的菌落。

2.3細菌的生長特性這3株菌的溫度生長范圍存在一定的差異性，菌株Ⅳ在20～35 ℃范圍內生長，20 ℃下微弱生長，高于35 ℃幾乎不生長。菌株V在10～40 ℃范圍內都能生長，并且沒有太大的生長速度差異。菌株VI在20～30 ℃范圍內生長，低于20 ℃時仍能微弱生長，10 ℃時完全不生長，高于30 ℃時幾乎不生長。在鹽度3%～5%的范圍內這3株細菌生長非常良好；若此鹽度范圍，這3株細菌表現出一定的生長差異性。在pH高于7的范圍內，這3株菌都能良好生長，證明這3株細菌都是嗜堿性的。

2.4生理生化特征 由表2可知，這3株細菌在一些陽性項目上的差異是比較明顯的。由于菌株Ⅳ在TCBS瓊脂平板培養基上的菌落不顯示黃色以及它對O/129抑制劑不敏感，因此初步斷定這株細菌不是弧菌屬細菌。菌株Ⅴ和菌株Ⅵ在TCBS平板上的菌落都呈明顯黃色的菌落，對O/129特征性抑制劑敏感，因此可將菌株Ⅴ和Ⅵ確定為弧菌屬細菌。經查閱相關文獻，發現菌株Ⅴ在一些指標上與溶藻弧菌(Vibrio alginolytocus)非常相似，初步判斷菌株Ⅴ為溶藻弧菌。由于菌株Ⅵ還未查到與其生理生化特征相同或相似的菌株，暫時鑒定為弧菌屬細菌。

2.5 16SrRNA基因序列分析和系統發育樹的構建將這3株細菌16SrRNA基因序列分別輸入GenBank數據庫中進行相似性檢索，結果發現與菌株Ⅳ相似性最高的前100個序列中50%以上的序列是未鑒定的或非可人工培養的細菌。其中相似率最高的為一種UnculturableMariana eubacterium細菌的16SrRNA序列，相似率為99.79%。與菌株Ⅴ相似性最高的前100個序列中91%為弧菌屬細菌，與其最相近的1條16SrRNA序列是溶藻弧菌(V.alginolyticus)的16SrRNA序列，相似率為99.58%。與菌株Ⅵ相似性最高的前100個序列中87%為弧菌屬細菌，與其相似率最高的是大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)的16SrRNA序列，相似率為99.64%。

從GenBank數據庫中選取與菌株Ⅴ和菌株Ⅵ的16SrRNA序列相似性較高的29株細菌的16SrRNA序列進行系統發育學分析，并構建系統發育樹。從圖2可以看出，B5(菌株Ⅴ)與V.alginolyticus自然聚類成一個分支，B6(菌株Ⅵ)與V.scophthalmi自然聚類成一個分支。B4(菌株Ⅳ)則單獨形成一個分支。

綜合生理生化特征的試驗結果和16SrRNA系統發育學分析的結果，可初步判斷從患白便病的大菱鲆腸道中分離的3株優勢細菌中2株分別為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)。另1株優勢菌由于沒有相似率較高的已知種菌株可供比對，暫時還是一種未知細菌。

表2　分離菌株的主要生化特征

注：(+)表示弱陽性生長。

Note: +indicatedweakpositivegrowth.

圖2　16S rRNA基因序列的聚類分析結果Fig. 2　Results of 16S ribosomal RNA cluster analysis

3　結論與討論

腸炎病是養成期大菱鲆的常見疾病，流行范圍較廣，在黃渤海沿岸的大菱鲆養殖區發生較為普遍。腸炎病雖然是內臟器官的病變，但具有典型的外觀發病特征，在生產過程中比較容易發現和識別。針對來源不同的樣品，筆者對腸炎病進行病原分離，發現其發病機理比較復雜。筆者從腸道白便中分離到大菱鲆弧菌、溶藻弧菌和1株目前還無法定種的非弧菌屬細菌。從病原學的研究結果來看，與白便病發病相關的細菌可能不止1種。

溶藻弧菌是我國近海海水養殖業的常見病原菌之一，可造成多種魚、蝦、貝類的死亡[5-8]。目前在我國關于該菌對養殖大菱鲆的病害研究還屬于空白，盡管已經從發病的大菱鲆體內檢測到溶藻弧菌，并已證實在大菱鲆腸炎病發病狀態下溶藻弧菌是優勢菌群之一，但對于該種弧菌確切的入侵方式、準確的致病力以及是原發病原還是繼發病原還需要更深入的研究。大菱鲆弧菌是弧菌屬中命名種名時間不長的一種細菌。據報道，大菱鲆弧菌是大菱鲆幼苗期腸道中占優勢數量的一種細菌，正常情況下并無致病性[9-10]。大菱鲆弧菌在來自不同地理區域的大菱鲆樣品腸道中都能被檢測出來，在一些育苗場的水體中和活餌體內也曾被檢測出來，但在一些池底沉積物中并不常見[11]。在其他的海水養殖魚類中還沒有分離到大菱鲆弧菌的報道，國內的文獻也沒有關于大菱鲆弧菌致病性的研究報道。據此推斷，大菱鲆弧菌可能是大菱鲆引進養殖過程中帶入我國的一個新菌種，它是健康大菱鲆腸道中的正常優勢菌群，但在大菱鲆患有一些消化道疾病和其他病原菌的入侵下是可能轉變為致病菌的，屬于繼發性病原。然而，關于該菌一些病原學方面的具體特性還需要深入的研究。此外，在大菱鲆的腸道疾病中還分離到1株未知的非弧菌屬細菌，通過對其生理生化特征和16SrRNA基因序列的研究，并未在已有文獻資料中找到相似性很高的已鑒定菌種，對這株細菌和相關病原學方面將開展更為深入的研究。

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EpizooticandAetiologicalStudyontheEnteritisDiseaseinCulturedScophthalmus maximus

JIANGYan1,CUIXiao-cui1,ZHANGZheng2*etal

(1.CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian,Shandong116023; 2.YellowSeaFisheriesResearchInstitute,Qingdao,Shandong266071)

[Objective]ToresearchtheepidemiologyandetiologyoftheenteritisdiseaseinculturedScophthalmus maximus. [Method]PathogenicbacteriawereisolatedfromS. maximuswithenteritisdiseaseindifferentaquaticplantsofShandongpeninsula.Thetraditionalphysiologicalandbiochemicaltestsand16SrRNAsequencinganalysiswerecarriedout. [Result]ThreestrainswereisolatedfromthediseasedS. maximus.ResultsofphysicochemicalcharacteristicsshowedthattwostrainswerethesameasVibrio alginolyticusandVibrio scophthalmi,whiletheotherstrainwasidentifiedtobebacteriumnotbelongingtoVibrio,andfurtherresearchwasstillneeded.The16SrRNAsequenceofthetwostrainswasanalyzedandmolecularphylogeneticdendrogramwereconstructed.ResultshowedthattherewashighlevelofconsanguinitybetweenVibrio alginolyticusandVibrio scophthalmi. [Conclusion]ThetwostrainsisolatedfromS. maximusareidentifiedtobeVibrio alginolyticusandVibrio scophthalmi.

Scophthalmus maximus;Enteritisdiseases; 16SrRNA; Vibrio alginolyticus; Vibrio scophthalmi

姜燕(1990- )，女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向：水產動物病害防控。*通訊作者，副研究員，博士，碩士生導師，從事水產動物病原學研究。

2016-05-10

S941

A

0517-6611(2016)17-123-04