蒲公英綠原酸的酶法提取及其在卷煙中的應用

倪 悅，徐 達，孫 強，鄧 宇，田耀偉，陳若星

(江西中煙工業有限責任公司技術研發中心，江西南昌 330096)

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蒲公英綠原酸的酶法提取及其在卷煙中的應用

倪 悅，徐 達，孫 強，鄧 宇，田耀偉*，陳若星

(江西中煙工業有限責任公司技術研發中心，江西南昌 330096)

[目的] 研究不同提取方法對蒲公英綠原酸提取效率的影響并完成工藝優化，通過加料評吸試驗為蒲公英綠原酸在卷煙中的應用提供參考。[方法]采用3種提取方法對蒲公英綠原酸進行提取，針對酶解醇提法進行工藝優化，考察酶液添加量、料液比、酶解溫度、酶解時間對綠原酸提取效率的影響，并通過正交試驗確定最優工藝條件。[結果]最優工藝條件為：酶液添加量為3mL，料液比為1∶12g/mL，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為3h。按照上述最優工藝條件制備得到的蒲公英提取物中，綠原酸提取率可達5.33mg/g。將該提取物產品按照0.1%加料進行卷煙應用研究，結果顯示：卷煙的甜潤感、刺激性、余味、干燥感均有較為明顯的提升，同時在煙香和香氣濃度上損失也較小，總體較為均衡。[結論]酶解醇提法在蒲公英綠原酸提取中具有較高的效率，該提取物應用于卷煙中能顯著提高煙氣的感官舒適性，在煙用香料領域有一定的應用前景。

蒲公英；綠原酸；酶解；工藝優化

蒲公英，別名黃花地丁、黃花三七、婆婆丁等，原產于歐洲，臨床常用中藥，有清熱解毒、消腫散結、利尿通淋之功效。蒲公英提取物中含有大量的多糖類、有機酸類等多種活性成分，其中的綠原酸是一種多酚類物質，具有重要的生理活性。試驗證明，蒲公英中的有機酸(以綠原酸為主)可以明顯降低煙氣刺激性，提高香氣質量，故而蒲公英提取物常被用作煙用香料應用于卷煙中。

目前，國內針對蒲公英的提取研究較多，但提取手段十分單一，主要是水提、醇提法[1]。近年來，有研究者采用纖維素酶對蒲公英進行了初步的探索，但未對酶解法提取優勢進行闡述，缺乏各種工藝方法間的提取效率對比。鑒于此，筆者通過3種提取工藝對比篩選后，采用復合植物水解酶ViscozymeL先對蒲公英的細胞壁物質進行預處理，提高其中綠原酸等有機酸的溶出率，然后采用50%的醇水體系對蒲公英綠原酸進行提取，最后針對該提取物進行了卷煙加料應用研究。目前，綠原酸提取的原料主要是金銀花、杜仲葉、甘薯、杭白菊、牛蒡葉等[2-3]，該研究為這類天然本草提取物在卷煙中的應用提供了技術依據。

1　材料與方法

1.1材料蒲公英，江西匯仁藥業有限公司，粉碎過40 目篩；復合植物水解酶ViscozymeL(酶活≥100FBG/g，FBG為真菌β-葡聚糖酶單位)，諾維信公司，使用前配成 1g/L酶溶液；綠原酸標準品(純度>98%)，北京中科三捷生物有限公司；殼聚糖、無水乙醇，均為分析純。

主要儀器設備：MRHei-standard磁力加熱攪拌器，德國Heidolph公司；LX-300冷卻水循環機，北京長流科學儀器公司；CP2245電子天平，德國Sartorius公司；Lambda750紫外分光光度計，美國PE公司；HW·YS型數顯恒溫水浴鍋，浙江舟山市定海區海源儀器廠。

1.2蒲公英綠原酸的提取

1.2.13種提取工藝。工藝A(酶解醇提法)：準確稱取1g蒲公英干粉置于50mL的圓底燒瓶中，按照1∶10g/mL的料液比用10g去離子水作為溶劑，加入2mL酶液進行酶解，控制酶解溫度45 ℃，酶解時間為2h。完成后，加入10g乙醇(50%醇水體系)進行水浴回流2h，之后加入3mL10g/L殼聚糖溶液，靜置2h，抽濾、濃縮至10g即得。

工藝B(酶解水提法)：準確稱取1g蒲公英干粉置于50mL的圓底燒瓶中，首先采用10g去離子水作為溶劑，加入2mL酶液進行酶解，pH保持自然狀態，45 ℃水浴2h。完成后，提高溫度至100 ℃進行水浴回流2h，之后加入3mL10g/L殼聚糖溶液，靜置2h，抽濾、濃縮至10g即得[4]。

工藝C(醇提法)：準確稱取1g蒲公英干粉置于50mL的圓底燒瓶中，采用50%乙醇溶液20g作為提取溶劑，搖勻，密封置于水浴鍋中水浴(80 ℃)回流2h，加入3mL10g/L殼聚糖溶液，靜置2h，抽濾、濃縮至10g即得[5-6]。

1.2.2影響蒲公英綠原酸提取效率的單因素試驗。

1.2.2.1酶液添加量。按照“1.2.1”的工藝A試驗方法，控制液料比為1∶10g/mL，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為2h，考察酶液添加量(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL)對蒲公英綠原酸提取效率的影響。

1.2.2.2料液比。根據“1.2.2.1”的試驗結果選擇最優的酶液添加量，控制酶解溫度為45 ℃，酶解時間為2h，考察料液比(1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15g/mL)對蒲公英綠原酸提取效率的影響。

1.2.2.3酶解溫度。根據“1.2.2.1”和“1.2.2.2”的試驗結果選擇最優的酶液添加量、料液比，控制酶解時間為2h，考察酶解溫度(25、35、45、55、65 ℃)對蒲公英綠原酸提取效率的影響。

1.2.2.4酶解時間。根據“1.2.2.1、1.2.2.2、1.2.2.3”的試驗結果，選擇最優的酶液添加量、料液比、酶解溫度，考察酶解時間(分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0h)對蒲公英綠原酸提取效率的影響。

1.2.3蒲公英綠原酸提取工藝的正交優化試驗。根據單因素的試驗結果，按照表1設計安排正交試驗L9(34)，考察4個因素對蒲公英綠原酸提取效率的綜合影響[7]。

表1蒲公英綠原酸提取效率的正交試驗因素水平

Table1Factorsandlevelsoforthogonaltestontheextractionrateofchlorogenicacidfromdandelion

水平Level因素Factor酶液添加量Enzymedosage(A)∥mL料液比Solid-liquidratio(B)g/mL酶解溫度Enzymolysistemperature(C)∥℃酶解時間Enzymolysistime(D)∥h111∶10351221∶12452331∶15553

1.3測定項目及方法

1.3.1綠原酸提取率測定。將提取物產品置于50mL容量瓶中定容，取200μL樣品溶液于10mL容量瓶中，放在60 ℃干燥箱中烘干，并用50%乙醇溶液(體積分數)定容，于波長327nm處測定吸光度，得到綠原酸的提取率。

綠原酸提取率=提取液中綠原酸質量(mg)/蒲公英干粉質量(g)

1.3.2蒲公英提取物在卷煙中的應用結果。采用金圣(軟紅)空白葉組，將3種不同制備工藝得到的蒲公英提取物添加到金圣(軟紅)葉組中，添加量為0.1%(以煙絲重量為基準)，參考中式卷煙風格感官評價方法[8-9]，組織5位評煙委員進行感官評吸，篩選出最優的制備方法。另外，采用香味輪廓法[10]針對工藝優化后的蒲公英提取物進行評吸，探索該蒲公英綠原酸在卷煙中的應用效果。

2　結果與分析

2.1綠原酸濃度標準曲線的建立采用50%的乙醇溶液(體積分數)配制42.5μg/mL綠原酸標準溶液。取適量綠原酸標準溶液，置于分光光度計中于波長200～500nm范圍內進行掃描，以體積分數為50%的乙醇溶液作參比，結果表明，在波長327nm處有最大吸收峰[11]。

標準曲線的繪制：精密吸取以上綠原酸標準溶液0、1、2、3、4、5mL，分別置于6個 10mL容量瓶中，加體積分數為50%的乙醇溶液定容，搖勻。在波長327nm處分別測定不同濃度標準溶液的吸光度，以綠原酸標準樣品濃度(μg/mL)為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。綠原酸濃度標準曲線見圖1，回歸方程為y=0.048 5x+0.098 6，相關系數R2=0.999 2，結果表明，在0～0.223 3μg/mL的濃度范圍內有較好的線性關系。

圖1　綠原酸濃度標準曲線Fig.1　Standard curve of chlorogenic acid concentration

2.23種提取工藝的提取效率比較3種提取工藝的提取效率見圖2，工藝A(酶解醇提法)的綠原酸提取率為3.85mg/g，顯著優于工藝B(0.84mg/g)和工藝C(2.38mg/g)。綠原酸易溶于乙醇，在水中的溶解度很小，所以工藝A、工藝C優于工藝B。另外，工藝A中，采用復合纖維素酶可以有效地針對蒲公英細胞壁物質進行水解，顯著促進提取效率，生成的還原糖類等小分子物質則對卷煙提質有積極的促進作用。

圖2　3種蒲公英綠原酸的提取工藝比較Fig.2　Comparison of three extraction technologies of chlorogenic acid

將3種不同制備工藝得到的蒲公英提取物添加到金圣(軟紅)葉組中，添加量為0.1%(以煙絲重量為基準)，不經加香直接手工卷制，平衡水分，參考行業標準進行感官評吸。由表2可知，4款卷煙評吸結果為：工藝A>工藝C>工藝B>空白；對比空白卷煙，添加了蒲公英提取物的卷煙在香氣質量以及木質雜氣方面有了整體的提高；工藝A制備得到的樣品整體得分最高，木質氣息和刺激性明顯減輕，潤感明顯，香氣質有提高，協調性相對較好，余味舒適。故接下來采用工藝A針對蒲公英進行酶解醇提法工藝優化試驗。

表2　3種蒲公英提取物的評吸結果比較

2.3蒲公英綠原酸的酶解醇提法工藝優化蒲公英的酶解醇提工藝優化首先針對酶液添加量、液料比、酶解溫度、酶解時間進行單因素優化，然后根據單因素優化結論進行正交試驗。

2.3.1酶液添加量對綠原酸提取率的影響。由圖3可知，綠原酸提取率隨著酶液添加量的增加而提高，在添加量為2mL后則提取率增加不明顯?？紤]到經濟性，確定2mL為最佳酶液添加量。

圖3　酶液添加量對綠原酸提取率的影響Fig.3　Effects of enzyme dosage on the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.2料液比對綠原酸提取率的影響。由圖4可知，綠原酸提取率隨著液料比中溶劑用量的增加而提高，在料液比1∶12g/mL后提取率增加不明顯。考慮到經濟性，確定1∶12g/mL為最佳料液比。

圖4　料液比對綠原酸提取率的影響Fig.4　Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.3提取溫度對綠原酸提取率的影響。由圖5可知，綠原酸提取率隨著提取溫度的升高先增加后降低，在溫度為45 ℃時提取率達到最高，繼續提高溫度則提取率降低。這可能是由于溫度過高，復合酶活性降低導致。

圖5　提取溫度對綠原酸提取率的影響Fig.5　Effects of enzymolysis temperature on the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.4提取時間對綠原酸提取率的影響。由圖6可知，綠原酸提取率隨著提取時間的增加而增加，在時間為2h時提取率達到較高水平，繼續增加提取時間則提取率增加不明顯。故選擇2h為最優的酶解時間。

圖6　提取時間對綠原酸提取率的影響Fig.6　Effects of enzymolysis time on the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.5蒲公英綠原酸的酶解醇提法工藝的正交試驗。由表3可知，以蒲公英綠原酸的提取率為評價標準，影響提取率酶解醇提工藝的因素大小依次為酶解溫度、酶解時間、酶液添加量、料液比。最佳工藝條件為A3B2C2D3，即酶液添加量為3mL、料液比為1∶12g/mL、酶解溫度為45 ℃、酶解時間為3h。經檢測，按照上述工藝條件制備得到蒲公英提取物中綠原酸提取率為5.33mg/g。

2.4含綠原酸的蒲公英提取物在卷煙中的應用采用香味輪廓分析法進行5人次評吸，結果如圖7和8所示，可以看到，隨著蒲公英提取物添加量的提高，卷煙的清香和甜香有了較為明顯的增強，并且在刺激性、干燥感和香氣的細膩感上有了較為明顯的增強[12]。在三類卷煙金圣(軟紅)空白葉組中添加量為0.1%時，卷煙的甜潤感、刺激性、余味、干燥感均有較為明顯的提升，同時在煙香和香氣濃度上損失也較小，總體較為均衡，為該蒲公英提取物在此款卷煙中較為合適的添加比例。

表3蒲公英綠原酸的酶解醇提法工藝的正交試驗結果

Table3Orthogonaltestresultsofenzymatichydrolysisandalcoholextractionmethodofchlorogenicacidfromdandelion

試驗號TestNo.因素FactorABCD綠原酸提取率Extractionrateofchlorogenicacid∥mg/g111112.55212224.62313334.01421235.04522313.87623124.23731324.33832134.56933214.67k13.733.973.783.70k24.384.354.784.39k34.524.304.074.54R0.790.381.000.84

3　結論與討論

通過對蒲公英綠原酸3種提取工藝的篩選，采用酶解醇提法具有較高的提取效率，并通過正交試驗確定了最優工藝條件：酶液添加量為3mL，料液比為1∶12g/mL，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為3h，按照上述最優工藝條件制備得到的蒲公英提取物中綠原酸提取率可達5.33mg/g。該提取物按照0.1%加料添加在卷煙中，卷煙的甜潤感、刺激性、余味、干燥感均有較為明顯的提升，同時在煙香和香氣濃度上損失也較小，總體較為均衡。

圖7　中式卷煙風格感官評價結果(未添加蒲公英提取物)Fig.7　Sensory evaluaion results of Chinese style cigarette(not adding dandelion extracts)

圖8　中式卷煙風格感官評價結果(添加0.1%蒲公英提取物)Fig.8　Sensory evaluaion results of Chinese style cigarette(adding 0.1% dandelion extracts)

該研究將酶技術應用在了蒲公英綠原酸的提取中，相對于綠原酸提取領域單一的方式方法有一定的借鑒意義。目前，多項研究表明，綠原酸對卷煙抽吸品質有積極的提升效

果，該研究提取得到的蒲公英綠原酸將在卷煙香料領域中具有廣泛的應用前景。

[1] 楊祖金，江燕斌，葛發歡，等.超濾膜技術分離杜仲葉綠原酸的研究[J].中藥材，2008，31(4)：585-588.

[2] 林丹，趙國玲，劉佳佳.金銀花不同提取方法的綠原酸比較研究[J].天然產物研究與開發，2003，15(2)：124-126.

[3] 向昌國，李文芳，聶琴，等.甘薯莖葉中綠原酸提取方法的研究及含量測定[J].食品科學，2007，28(1)：126-130.

[4] 林春梅.蒲公英中綠原酸纖維素酶法提取工藝的優化[J].湖北農業科學，2012，51(18)：4097-4100.

[5] 沈奇，趙厚民，張衛民，等.蒲公英綠原酸提取分離工藝的研究[J].食品科學，2006，27(7)：140-143.

[6] 楊茉.金銀花中有效成分的提取工藝優化研究[D].天津：天津醫科大學，2009：17-22.

[7] 梁運霞，宋德花，劉廣文，等.正交試驗法優選蒲公英中綠原酸水提工藝研究[J].中獸醫醫藥雜志，2008(1)：33-35.

[8] 武怡，曾曉鷹，朱保昆，等.中式卷煙風格感官評價方法區域適應性分析[J].煙草科技，2012(9)：5-9.

[9] 閆克玉，于靜.金銀花揮發油的提取及在卷煙中的應用[J].鄭州輕工業學院學報，2008，23(5)：24-28.

[10] 徐達，蘇加坤，蔡繼寶.補骨脂揮發油的微囊化及其在卷煙中的應用研究[J].河南農業科學，2015，44(7)：148-152.

[11] 羅岳北.紫外分光光度法測定蒲公英中總有機酸的含量[J].化學與化工，2008(6)：54-64.

[12] 魏維偉.煙用香精香料的成分剖析研究[D].長沙：中南大學，2010：2-6.

EnzymaticExtractionofChlorogenicAcidfromDandelionandItsApplicationinCigarette

NIYue,XUDa,SUNQiang,TIANYao-wei*etal

(TechnologyResearchCenter,ChinaTobaccoJiangxiIndustrialCorporation,Nanchang,Jiangxi330096)

[Objective]Toresearchtheeffectsofextractionmethodsontheextractionrateofchlorogenicacidfromdandelion,tooptimizethetechnology,andtoprovidereferencesfortheapplicationofchlorogenicacidincigarettebysmokepaneltest. [Method]Chlorogenicacidwasextractedfromdandelionbythreemethods.Technologyoptimizationofenzymatichydrolysisandalcoholextractionmethodwascarriedout.Effectsofenzymedosage,solid-liquidratio,enzymolysistemperatureandenzymolysistimeontheextractionrateofchlorogenicacidwereresearched.Theoptimaltechnologyconditionwasconfirmedbyorthogonaltest. [Conclusion]Theoptimaltechnologyconditionwasasfollows: 3mLenzymedosage, 1∶12g/mLsolid-liquidratio, 45 ℃enzymolysistemperature,and3henzymolysistime.Underthiscondition,theextractionrateofchlorogenicacidindandelionextractswas5.33mg/g.Theextractswereusedforcigaretteaccordingtothepercentageof0.1%.Resultsshowedthatthesweet,irritation,aftertaste,drynessofcigarettewereimprovedobviously,withlowerlossoftobaccoaromaandaromaconcentration. [Conclusion]Enzymatichydrolysisandalcoholextractionmethodhasrelativelyhighefficiencyintheextractionofchlorogenicacidfromdandelion.Applyingtheextractsincigarettesignificantlyenhancesthesensorycomfortlessof,whichisofcertainapplicationprospectinthefieldoftobaccoflavors.

Dandelion;Chlorogenicacid;Enzymaticextraction;Technologyoptimization

江西中煙工業有限責任公司科技項目(贛煙工科計2014-05)。

倪悅(1985-)，男，江蘇蘇州人，助理工程師，碩士，從事卷煙產品研發。*通訊作者，工程師，碩士，從事卷煙香精香料開發與應用研究。

2016-05-03

TQ914.1

A

0517-6611(2016)17-107-04