紫外線對(duì)枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌株的誘變與篩選

馬加強(qiáng)， 吳 明，馬禮鵬， 劉 博

(中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 北京 100081)

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紫外線對(duì)枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌株的誘變與篩選

馬加強(qiáng)， 吳 明，馬禮鵬， 劉 博*

(中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 北京 100081)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種革蘭氏陽性菌，具有種類多、分泌蛋白能力強(qiáng)、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種重要工業(yè)酶和工業(yè)制劑的菌種，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、飼料、造紙和紡織等多種領(lǐng)域。為了進(jìn)一步提高枯草芽孢桿菌的發(fā)酵能力，采用紫外線照射的方法誘導(dǎo)篩選高產(chǎn)菌株。對(duì)通過紫外線誘導(dǎo)提高枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、α-乙酰乳酸脫羧酶(α-acetolactate decarboxylase，簡稱α-ALDC)、3-羥基丁酮(Acetoin)和葡萄糖-1-磷酸(Glucose-1-phosphate，簡稱G-1-P)能力的條件進(jìn)行了比較。

枯草芽孢桿菌；紫外線誘導(dǎo)；酶制劑；3-羥基丁酮；葡萄糖-1-磷酸

枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，呈直桿狀，內(nèi)生芽孢，好氧，其菌落不透明，呈白色或微黃色，表面粗糙，可將體內(nèi)生產(chǎn)的蛋白分泌到胞外。枯草芽孢桿菌廣泛分布于土壤、動(dòng)植物表面和湖波海洋中，正是因?yàn)槠渖瞽h(huán)境的多樣化，可以利用多種環(huán)境中豐富的物質(zhì)，所以細(xì)菌體內(nèi)有豐富的產(chǎn)酶系統(tǒng)，具有產(chǎn)生多種酶的潛力，可以生產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、果膠酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶木、聚糖酶、納豆激酶、維生素、寡糖、小肽、氨基酸、增味劑、葡萄糖-1-磷酸和3-羥基丁酮等，應(yīng)用于食品、紡織、醫(yī)藥、科研、造紙、皮革、環(huán)保與飼料養(yǎng)殖中[1-4]。枯草芽孢桿菌是經(jīng)我國農(nóng)業(yè)部認(rèn)定的2種飼料添加菌種之一，也是美國食品藥物管理局(FDA)認(rèn)定的安全菌種[5]。枯草芽孢桿菌是工業(yè)酶生產(chǎn)的主要菌種之一，僅有由其生產(chǎn)的蛋白酶、淀粉酶。其中，脂肪酶就占據(jù)整個(gè)酶市場的50%以上[1,3]。在食品領(lǐng)域，枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的酶占世界食品工業(yè)酶總量的60%以上，在我國食品工業(yè)酶中由枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的酶占85%以上。枯草芽孢桿菌作為一種發(fā)酵菌種，在很多方面都有大量應(yīng)用。

雖然枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)中起到了重要作用，但其產(chǎn)量仍未能滿足人類的需求。為了滿足人類在生產(chǎn)生活和環(huán)保、科研等方面的應(yīng)用，科研工作者通過物理和化學(xué)等方法對(duì)枯草芽孢桿菌的菌種進(jìn)行誘導(dǎo)，從中篩選出所需產(chǎn)品產(chǎn)量高的菌種進(jìn)行傳代培養(yǎng)，穩(wěn)定產(chǎn)量。物理誘變方法有很多，包括α射線、β射線、γ射線、Χ射線、中子和其他粒子、紫外線、微波等物理因素輻射促進(jìn)遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，其中紫外線誘導(dǎo)突變是工業(yè)為生物育種中最為普遍的一種。作為遺傳物質(zhì)的DNA，對(duì)紫外線有強(qiáng)烈的吸收作用，可以造成DNA的斷裂以及堿基的破壞，但其主要作用形式是通過同一條鏈上的相鄰或雙鏈之間的嘧啶形成二聚體，這是因?yàn)猷奏づc嘌呤相比對(duì)紫外線更為敏感，干擾DNA雙鏈的分開與堿基的配對(duì)，使DNA不能正常復(fù)制與表達(dá)，從而使微生物死亡或發(fā)生突變。由于紫外線與α射線、β射線、γ射線、Χ射線和中子等其他射線和粒子相比更加普及，操作方便，并且誘導(dǎo)效率高，不易發(fā)生回復(fù)突變，在微生物誘變育種中廣泛使用。筆者對(duì)用紫外線誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌育種提高生產(chǎn)效率的方法和結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比分析。

1　枯草芽孢桿菌的誘變和選育

1.1高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌菌株的誘變與選育蛋白酶可以催化肽鍵水解，廣泛應(yīng)用于食品加工、紡織、醫(yī)藥、皮革和洗滌劑等領(lǐng)域中。NIU C H等[5]從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中選取10株菌株，檢測(cè)蛋白酶的產(chǎn)量，從中選取酪素培養(yǎng)基平板上透明圈與菌落直徑比最大(3.01)的菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)2 h后每隔2 h取樣檢測(cè)OD值，選取生長曲線對(duì)數(shù)中前期的細(xì)菌進(jìn)行誘變?cè)囼?yàn)，在30 cm處進(jìn)行0～240 s間隔20 s的取樣，將所有樣品的菌懸液稀釋后在平板上涂布，以未經(jīng)紫外線處理的稀釋菌懸液涂布平板作為對(duì)照，經(jīng)過在37 ℃下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。選取照射時(shí)間180 s、致死率76.91%的菌落篩選后得到5株菌株，選擇正突變中透明圈與菌落直徑比值最大(5.52)的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，透明圈與菌落的比值分別為5.26、5.68、5.58、5.29和5.67，酶活力基本保持穩(wěn)定。

1.2高產(chǎn)胞外淀粉酶枯草芽孢桿菌菌株誘變于選育淀粉酶是一種在日常生產(chǎn)過程中應(yīng)用十分廣泛的一種酶，發(fā)揮消化酶的作用，治療消化類疾病，將其加入洗滌劑中可以提高洗滌劑的效用。此外，枯草桿菌產(chǎn)生的淀粉酶還可以分解水體中的餌料、動(dòng)物排泄物和有害氣體等，有助于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的同時(shí)還能凈化水質(zhì)。XIE F X等[6]從養(yǎng)蝦池、混養(yǎng)池底質(zhì)活性污泥和污染河流底質(zhì)活性污泥中通過革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色、淀粉酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)等鑒定篩選出12株菌株，接種到淀粉培養(yǎng)基上篩選出產(chǎn)酶能力最強(qiáng)(透明圈與菌落直徑最大)的2株菌株，比值分別為2.27和3.11，用3, 5-二硝基水楊酸法所測(cè)的酶活分別為38.66和37.10 U/mL，將這2株菌株接種到培養(yǎng)皿上距離25 cm用20 W的紫外線燈等進(jìn)行4 min間隔照射，分別選取致死率為91%與90%的培養(yǎng)基上的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶能力的測(cè)定，將其中酶活值達(dá)到最高的2株進(jìn)行第2次與第1次條件相同的誘變?cè)囼?yàn)，最終得到3株產(chǎn)酶能力最強(qiáng)的菌株，其透明圈與菌落比值分別為3.21、2.67和2.90，用3,5-硝基水楊酸法所測(cè)的酶活為56.95、50.47和50.02 U/mL。

1.3高產(chǎn)α-乙酰乳酸脫羧酶枯草芽孢桿菌菌株誘變與選育α-乙酰乳酸脫羧酶可以將乙酰乳酸(Acteolatato)直接轉(zhuǎn)化為乙偶姻(Actetoin)，而不必經(jīng)過雙乙酰(Diacetye)，因?yàn)殡p乙酰使在啤酒發(fā)酵中出現(xiàn)的造成不良風(fēng)味的一種物質(zhì)，因此被廣泛地應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)中。WANG Z等[7]選擇實(shí)驗(yàn)室中的枯草芽孢桿菌菌株BS059，采用波長260 nm、功率15 W的紫外線在距離30 cm處進(jìn)行照射，輻射時(shí)間分別為10、20、35、60和90 s，取誘變后的菌株進(jìn)行V.P.顯色反應(yīng)，結(jié)果表明在50 s時(shí)正突變率最大(43.3%)，此時(shí)存活率為21.15%，選取此時(shí)的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵藥瓶培養(yǎng)后得到2株酶活最高的菌株分別為0.627和0.792 U/mL，與出發(fā)菌株的酶活(0.302 U/mL)相比分別提高了107.62%和162.25%。

1.4高產(chǎn)3-羥基丁酮枯草芽孢桿菌菌株誘變與選育3-羥基丁酮，別名乙偶姻、甲基乙酰甲醇，是一種被我國GB2760-86和美國食品與萃取協(xié)會(huì)(FEMA)允許廣泛應(yīng)用的食用香料，可用于奶油、干酪和咖啡等食品的添加，并自然存在玉米、蘋果和可可香蕉中。YIN M H等[8]選用實(shí)驗(yàn)室保存的YD-1菌種先通過發(fā)酵培養(yǎng)后，采用肌酸甲萘酚法測(cè)定3-羥基丁酮的含量并采用DNS方法測(cè)定葡萄糖的含量。調(diào)整菌液濃度為107個(gè)/mL在照射距離為25 cm、紫外線功率15 W的條件下分別照射10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 s，取照射后的菌種稀釋10倍后培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，繪制致死曲線，選取誘變時(shí)間為30 s、致死率為80%的菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)得產(chǎn)量最高的菌株MB-2的產(chǎn)量最高(18.46 g/L),殘?zhí)橇繛?.38%，原菌株YD-1的3-羥基丁酮的產(chǎn)量為12.60 g/L，殘?zhí)橇繛?.87%，連續(xù)傳代20次，分別選取第5、10、15、20代進(jìn)行3-羥基丁酮含量的測(cè)定，3-羥基丁酮含量分別為18.32、18.72、18.10和18.62 g/L,產(chǎn)量保持相對(duì)穩(wěn)定。采用RAPD法檢測(cè)了DNA條帶，發(fā)現(xiàn)在3 000和3 800 bp處出現(xiàn)了2條不同于原菌種的條帶。

1.5高產(chǎn)葡萄糖-1-磷酸枯草芽孢桿菌菌株的誘變與選育葡萄糖-1-磷酸使動(dòng)物糖酵解中的重要產(chǎn)物，可以作為反應(yīng)起始物合成二磷酸葡萄糖苷、麥芽寡糖和海藻糖，此外它還是制備細(xì)胞增殖抑制、抗生素和抗癌劑的原料藥。為了提高葡萄糖-1-磷酸的產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的目的，許向華從土壤中篩選到1株葡萄糖-1-磷酸的枯草芽孢桿菌菌株，命名為BacillussublitisXH-13，測(cè)定生長曲線，選取培養(yǎng)12 h的菌懸液稀釋后涂布在平板上放在20 W的紫外燈下30 cm處，分別照射3、6、9、12、15和18 s，照射12 s后致死率達(dá)到79.17%，采用高相液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行(HPLC-MS)檢測(cè)，出發(fā)菌株的葡萄糖-1-磷酸的產(chǎn)量為4.45 g/L，誘變菌株中的最高產(chǎn)量為5.58 g/L,此后進(jìn)行第2輪和第3輪誘變，所得的菌株的最高產(chǎn)量分別為6.63和6.85 g/L，對(duì)第3輪誘變后最高產(chǎn)量的菌株進(jìn)行6代傳代培養(yǎng)，所得到的每代菌株的葡萄糖-1-磷酸的產(chǎn)量的平均值為6.843～6.863，菌株產(chǎn)量十分穩(wěn)定。

1.6高產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌菌株的誘變與選育植酸酶可以改善飼料的質(zhì)量，提高禽畜對(duì)飼料的利用率，改善家畜肉質(zhì)，減少家畜對(duì)磷元素的排泄，從而降低對(duì)環(huán)境的污染。BAO Z G[4]用紫外線、亞硝基胍(NTG)和紫外線-亞硝基胍復(fù)合法對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行誘變育種，其中以紫外線的酶活提高效率最高。選用中國微生物菌種保藏中心的枯草芽孢桿菌B10333，涂布于培養(yǎng)皿上置于距20 W紫外燈距離30 cm處分別照射0、20、40、60、80和100 s。選取照射100 s、致死率為77.2%的菌株進(jìn)行篩選，采用GBT法測(cè)定酶活，出始菌株的酶活為51.97 U/mL,誘變后的菌株產(chǎn)酶酶活為71.96 U/mL。對(duì)誘變菌株進(jìn)行5代傳代培養(yǎng)，并分別進(jìn)行WEB液體培養(yǎng)基搖床發(fā)酵培養(yǎng)，植酸酶活性的平均值為71.78～72.07 U/mL，遺傳較為穩(wěn)定。

2　枯草芽孢桿菌紫外誘變的對(duì)比分析

枯草芽孢桿菌作為一種常用的發(fā)酵菌種，可以用來生產(chǎn)多種酶和化學(xué)產(chǎn)品，但為了提高產(chǎn)品的產(chǎn)量所用的誘導(dǎo)條件各不相同，結(jié)果也有所差異。在使用紫外線進(jìn)行枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)時(shí)，紫外線強(qiáng)度大多為15～20 W，輻射距離為25～30 cm，但各自所用輻射時(shí)間差異較大，最終經(jīng)過紫外線的輻射后枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的產(chǎn)物產(chǎn)量大多提升50%左右，經(jīng)過傳代培養(yǎng)，傳代后的枯草芽孢桿菌產(chǎn)物產(chǎn)量較為穩(wěn)定，與誘變后的第1代產(chǎn)量相比穩(wěn)定在90%左右，甚至高達(dá)99%～101%，基本不變(表1)。

3　討論

枯草芽孢桿菌作為一種工業(yè)上的主要發(fā)酵菌種之一，可以存活于多種環(huán)境中，同時(shí)產(chǎn)生多種酶類，包括α-淀粉酶、淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶和納豆激酶等，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、紡織、食品、農(nóng)業(yè)、畜牧、科研和環(huán)境防治等領(lǐng)域。納豆激酶(絲氨酸蛋白激酶)具有溶栓作用，可以用于心血管疾病的防治；淀粉酶和纖維素酶可以發(fā)揮體內(nèi)消化物質(zhì)的作用，用作胃腸消化疾病的藥物；蛋白酶可用于分解傷口發(fā)炎部位的纖維蛋白的凝結(jié)物，有助于傷口附近腐肉、黏塊和碎屑的清理，可用于損傷藥處理傷口時(shí)的傷口清洗。枯草芽孢桿菌可直接將所表達(dá)的蛋白分泌到體外，簡化了生產(chǎn)工藝，但其分泌的降解蛋白酶也會(huì)對(duì)產(chǎn)物造成影響，也缺乏專用的表達(dá)載體。利用枯草芽孢桿菌制成的活菌制劑殺菌劑在防治白粉病、霜露病、灰霉病、水稻稻瘟病和小麥紋枯病等多種農(nóng)作物的疾病上都有顯著作用，已在多個(gè)國家中注冊(cè)并應(yīng)用于商業(yè)中。在飼料中添加枯草芽孢桿菌有助于飼料中氮和磷的吸收，同時(shí)造成厭氧環(huán)境有助于腸胃中厭氧微生物的生長促進(jìn)腸胃中的消化，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中還可分解水中污染物，在凈化水質(zhì)的同時(shí)可以提高水中的營養(yǎng)含量。此外，枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的酶還可用于加入洗滌劑清洗衣物、造紙中的脫墨、羊毛和彩棉紡織品的處理以及皮革生產(chǎn)中等。由于酶的廣泛應(yīng)用使得2004年酶制劑的全球交易額已達(dá)到20億美元，而枯草芽孢桿菌所生產(chǎn)的酶在市場中占50%以上，但是由于科研水品的限制，我國的酶制劑工業(yè)遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到世界先進(jìn)水平，提高枯草芽孢桿菌酶制劑的產(chǎn)量也是其中的重要工作之一。

表1　枯草芽孢桿菌紫外誘變育種條件和結(jié)果的比較

通過對(duì)多個(gè)枯草芽孢桿菌紫外線誘變育種的比較，筆者發(fā)現(xiàn)雖然所用的紫外線照射的條件相似，但照射的時(shí)間卻有所不同。盡管如此，最終所得的結(jié)果與原菌種相比產(chǎn)量大都提升了50%，但很難再有大幅度提升。BAO Z G[4]在研究植酸酶的發(fā)酵時(shí)曾用紫外線誘變使酶活提高了38.46%，以NTG誘導(dǎo)使酶活提升了35.04%，用UV-NTG與NTG-UV復(fù)合誘導(dǎo)提高36.98%和26.28%，說明紫外線誘導(dǎo)所造成的正突變效果相對(duì)顯著。大量研究表明當(dāng)致死率達(dá)到70%～80%時(shí)，正突變頻率較高，王洲所繪制的變異曲線表明當(dāng)照射時(shí)間為50 s時(shí)正突變率最大達(dá)到43.33%，同時(shí)變異率也達(dá)到最大(73.3%),此時(shí)的致死率為78.85%[5,7,9]。上述研究大都選擇致死率為70%～80%，接近80%，但到達(dá)致死率所用的時(shí)間不同，較短時(shí)只需十幾秒，較長時(shí)要用幾十秒甚至幾分鐘，其主要原因是因?yàn)橛行┭芯肯葘⑴渲频木鷳乙褐糜谧贤鉄粝逻M(jìn)行誘變，然后進(jìn)行稀釋菌液涂布平板，因?yàn)橐獙?duì)所有細(xì)菌進(jìn)行充分照射，所用的時(shí)間較長。NIU C H等[5]誘導(dǎo)高產(chǎn)蛋白酶菌株；XIE F X等[6]誘導(dǎo)高產(chǎn)淀粉酶菌株；WANG Z等[7]誘導(dǎo)高產(chǎn)α-ALDC等；而有些研究先進(jìn)行平板的涂布，再直接進(jìn)行紫外線誘變，所用時(shí)間較短。XU X H等[9]對(duì)葡萄糖-1-磷酸高產(chǎn)菌種的選育。此外，菌液的濃度也會(huì)造成一定的影響。雖然紫外線照射強(qiáng)度和距離和培養(yǎng)基種類等也會(huì)對(duì)達(dá)到合適致死率時(shí)間有所影響，但最主要的因素還是兩種因素。雖然大多數(shù)誘變方式是進(jìn)行菌液的照射，但筆者認(rèn)為后一種照射方式能夠更加均勻地照射到所有菌株，適合誘變選育。進(jìn)行誘變和涂布時(shí)要選擇合適的菌液濃度，防止?jié)舛冗^大或過小使得計(jì)數(shù)不便，照射時(shí)大多會(huì)選用濃度為107個(gè)/mL或108個(gè)/mL的菌液[7-8],進(jìn)行涂布時(shí)選用100個(gè)/mL或1 000個(gè)/mL的菌液濃度，方便計(jì)數(shù)。生物體內(nèi)有通過光修復(fù)或暗修復(fù)應(yīng)對(duì)損傷的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，因此在進(jìn)行紫外線誘變后要在紅光下進(jìn)行防止枯草芽孢桿菌進(jìn)行回復(fù)突變。對(duì)于已經(jīng)選擇的菌株在進(jìn)行誘變前最好再進(jìn)行一次生長時(shí)期的篩選，選擇進(jìn)入生長期的菌株，在此時(shí)期不僅菌群的生活狀態(tài)較為一致，代謝效率較高，而且由于處于快速繁殖時(shí)期，DNA復(fù)制較為頻繁，突變率高。由于所使用的培養(yǎng)基和初始培養(yǎng)時(shí)的菌液濃度不盡相同，所以對(duì)數(shù)生長期也不同，因此在研究時(shí)要選擇合適的培養(yǎng)基和初始菌液濃度，減少培養(yǎng)基用量，將初始菌液濃度控制在一定范圍，將菌落的對(duì)數(shù)生長期控制在6～8 h，節(jié)省研究時(shí)間和材料用量。在進(jìn)行紫外線誘變后，菌種內(nèi)的遺傳物質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，會(huì)導(dǎo)致菌種死亡或發(fā)生正突變或負(fù)突變。YIN M H等[8]和WANG Z等[7]的研究表明經(jīng)過誘變的菌株的會(huì)與原菌株的DNA條帶有所差異，可能會(huì)多出條帶，也可能相同位置的條帶更亮，說明經(jīng)誘變后菌株DNA確實(shí)發(fā)生了變異可能是基因結(jié)構(gòu)的改變，也可能是相同片段的重復(fù)增加。此外，WANG Z等[7]的突變曲線表明正突變?cè)陔S著照射時(shí)間的

增加會(huì)有一個(gè)最大值，但負(fù)突變可能會(huì)在1個(gè)峰值出現(xiàn)后繼續(xù)增大。

4　結(jié)論

在設(shè)計(jì)對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行紫外線誘變提高產(chǎn)品產(chǎn)量的試驗(yàn)時(shí)，常在20～30cm處以15～20W的功率進(jìn)行間隔照射，對(duì)菌液照射到的話間隔時(shí)長大多為10～20s，有時(shí)也可用梯度間隔，設(shè)置6～10個(gè)間隔，選取致死率為70%～80%的存活菌種進(jìn)行培養(yǎng)，最終產(chǎn)物的產(chǎn)量大約會(huì)提升50%左右，且后代基本保持穩(wěn)定不變。

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Mutation and Screening of Ultraviolet Radiation on Strains Production ofBacillussubtilis

MA Jia-qiang, WU Ming, MA Li-peng, LIU Bo*

(College of Life and Environmental Sciences, Minzu University of China, Beijing 100081)

Bacillussubtilisis a kind of gram positive bacteria, which has many advantages, such as abundant varieties, strong ability of secreting protein, good safety and so on. It is a kind of important industrial enzyme and industrial formulation, and has been widely used in many fields, such as medicine, food, agriculture, feed, paper and textile. In order to further improve the fermentation ability ofBacillussubtilis, the high yield strain was induced by UV irradiation. The conditions for improving the production of amylase, protease, α-ALDC, acetoin, glucose-1-phosphate were compared by ultraviolet radiation.

Bacillussubtilis; Ultraviolet mutation; Enzyme preparation; Acetoin; Glucose-1-phosphate

馬加強(qiáng)(1994- )，男，山東荷澤人，本科生，專業(yè)：生物技術(shù)。*通訊作者，講師，從事民族植物學(xué)與民族資源學(xué)研究。

2016-05-18

S 182

A

0517-6611(2016)17-018-03