L-纈氨酸對精氨酸酶Ⅰ抑制作用的分子動力學(xué)模擬

黃義玲, 高雪峰

(吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長春 130012)

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L-纈氨酸對精氨酸酶Ⅰ抑制作用的分子動力學(xué)模擬

黃義玲, 高雪峰

(吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長春 130012)

摘要利用分子動力學(xué)模擬與酶學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法, 研究了L-纈氨酸(L-Val)對野生型和突變型精氨酸酶Ⅰ的酶促反應(yīng)動力學(xué)的影響. 精氨酸酶Ⅰ的活性口袋附近有一個較大的空穴C2, 分子動力學(xué)模擬結(jié)果顯示, 突變Ile156Arg縮小了空穴C2的容積, 而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, L-Val對突變型精氨酸酶Ⅰ抑制劑的半抑制濃度(IC50)由3.06 mmol/L升高到6.26 mmol/L, 增加了1倍, 因此精氨酸酶Ⅰ可能存在一個位于空穴C2的調(diào)節(jié)位點(diǎn), 并且L-Val可以結(jié)合于此干擾精氨酸酶Ⅰ的活性.

關(guān)鍵詞精氨酸酶Ⅰ; 分子動力學(xué)模擬; 突變; 半抑制濃度; 調(diào)節(jié)位點(diǎn); L-纈氨酸

精氨酸酶(Arginase,EC3.5.3.1)是一種含錳的金屬酶, 以2種同工酶形式存在于人和哺乳動物的不同組織器官中, 通過錳活化羥基機(jī)制催化L型精氨酸發(fā)生水解反應(yīng), 生成尿素和鳥氨酸, 這一反應(yīng)在體內(nèi)的代謝過程中起到了關(guān)鍵作用[1]. 精氨酸酶Ⅰ(ArginaseⅠ)主要的表達(dá)位置是肝臟, 其催化精氨酸發(fā)生水解作用, 使精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩? 然后通過尿液排出體外[2～5]. 精氨酸酶Ⅱ(ArginaseⅡ)是一種線粒體酶, 主要存在于腦、 腎和骨骼肌等組織中, 它不影響尿素循環(huán), 其主要功能是控制精氨酸的含量從而使細(xì)胞內(nèi)的鳥氨酸達(dá)到一種平衡狀態(tài), 調(diào)控體內(nèi)一氧化氮、 脯氨酸和多胺等物質(zhì)的合成過程[6～9]. 對于細(xì)胞的增殖和分化過程, 多胺是一種不可缺少的物質(zhì), 它在上述過程中起到非常重要的作用[10,11]. 脯氨酸的主要作用是促進(jìn)膠原蛋白分泌以及加快傷口愈合[12,13]. 當(dāng)生物體缺乏精氨酸酶時, 可能導(dǎo)致一些精氨酸酶缺陷癥的發(fā)生, 如身體發(fā)育遲緩及神經(jīng)系統(tǒng)缺陷等[14～16]. 因此, 對精氨酸酶的相關(guān)性研究一直備受關(guān)注, 并將其當(dāng)作疾病治療的靶標(biāo)酶, 研究不同物質(zhì)對其活性的影響, 使得精氨酸酶在新藥開發(fā)方面?zhèn)涫苤匾昜8,9].

通常認(rèn)為L-纈氨酸(L-Val)對精氨酸酶起抑制作用, 其抑制作用的類型是競爭性抑制, 同時也有研究指出L-Val與精氨酸酶不是以摩爾比1∶1結(jié)合, 即可能存在其它結(jié)合位點(diǎn)[17]. 本文通過計(jì)算機(jī)模擬和酶學(xué)實(shí)驗(yàn)研究相結(jié)合的方法, 研究了精氨酸酶Ⅰ的結(jié)構(gòu)特征, 以及野生型和突變型精氨酸酶Ⅰ的酶促反應(yīng)動力學(xué), 發(fā)現(xiàn)精氨酸酶Ⅰ表面可能存在一個調(diào)節(jié)位點(diǎn), 而且L-Val可能結(jié)合于此位點(diǎn)抑制酶的活性. 為以精氨酸酶為靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)、 開發(fā)、 改造等提供新思路.

1分子動力學(xué)模擬

Fig.1　Three-dimensional structure of ArginaseⅠ The secondary structure of ArginaseⅠis shown by ribbon model, His141 is shown by tube model, Mn2+ is shown by two balls, the α-helix is H1-helix between C1 and C2.

在精氨酸酶Ⅰ表面有2個大空穴(即C1和C2), 2個空穴通過一段α螺旋H1相連, 二者的相對位置如圖1所示.C1為活性口袋, 是2個Mn2+和催化關(guān)鍵氨基酸His141所在的空穴, 容積約6.6×10-3nm3,C2與C1相鄰, 是酶表面的另一個空穴, 由一段Loop環(huán)圍繞而成, 容積約3.74×10-3nm3. L-Val的分子比較小, 所以L-Val有可能結(jié)合在除了活性口袋C1以外的空穴C2內(nèi). 為了縮小C2的容積, 降低L-Val的結(jié)合機(jī)率, 根據(jù)C2的空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和氨基酸分布, 將異亮氨酸(Ile)156突變?yōu)榫珰渌?Arg), 隨后進(jìn)行分子動力學(xué)模擬, 觀察突變后精氨酸酶Ⅰ的空穴C1及C2的空間結(jié)構(gòu), 特別是空穴C2的容積變化. 采用人源精氨酸酶Ⅰ的X射線衍射結(jié)構(gòu)(PDB編號: 2ABE), 刪除其結(jié)晶水, 加氫, 然后優(yōu)化. 通過spdbv程序?qū)⒁吧途彼崦涪竦慕Y(jié)構(gòu)空穴C2內(nèi)的Ile156突變?yōu)锳rg, 突變后的結(jié)構(gòu)先固定除了Arg156以外的氨基酸殘基, 對Arg156進(jìn)行能量優(yōu)化和800K的模擬退火. 對突變型精氨酸酶Ⅰ和野生型精氨酸酶Ⅰ同時進(jìn)行模擬, 即無約束的50ns分子動力學(xué)模擬. 運(yùn)用GROMACS4.5程序, 在ffG43a2力場下進(jìn)行, 使用的模型為spc216水模型[18～22],Mn2+離子的參數(shù)用Zn2+離子參數(shù)替代. 首先, 對酶進(jìn)行能量優(yōu)化, 然后固定復(fù)合物對水分子進(jìn)行1ns的分子動力學(xué)模擬, 使復(fù)合物充分“浸泡”在溶劑中, 然后對酶進(jìn)行50ns的分子動力學(xué)模擬, 靜電相互作用采用PME理論, 非鍵相互作用的cut-off值為0.9,rcoulomb值為1.2, 步長為2fs, 每200步(0.4ps)保存一個構(gòu)象, 壓力耦合采用semiisotropic方式, 耦合常數(shù)為0.1ps, 設(shè)定復(fù)合物分子和水的耦合溫度均為300K, 耦合常數(shù)為0.1ps[23].

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

酶標(biāo)儀MultiskanFC(Thermoscientific). L-Arg和L-Val(Sigma公司); 人源精氨酸酶Ⅰ質(zhì)粒由清華大學(xué)生命科學(xué)院提供.

2.2實(shí)驗(yàn)原理

精氨酸酶催化 L-Arg水解為L-鳥氨酸和尿素(Scheme1), 尿素與鄰苯二甲醛(oPA)和N-(1-萘基)乙烯-二胺鹽酸鹽(NED)形成特有的紅色復(fù)合物, 顏色的深淺與尿素濃度成正比, 因此可以通過測定反應(yīng)體系的尿素濃度來獲取酶的動力學(xué)信息. 反應(yīng)體系在37 ℃反應(yīng)2h, 加入冷的終止顯色液(1.6mmol/LoPA, 0.8mmol/LNED), 室溫靜置顯色20min, 立即于520nm處測定吸光度[23,24].

Scheme 1　Catalytic reaction by Arginase Ⅰ

2.3酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)測定

酶的活力單位定義為在一定的酶和底物濃度下, 每分鐘水解精氨酸的微摩爾數(shù), 其與反應(yīng)速率成正比, 故酶的活性大小可用一定的酶和底物濃度下的反應(yīng)速率來表征. 分別表達(dá)并純化了突變型及野生型精氨酸酶Ⅰ, 測定L-Val對2種酶的活性影響. 緩沖體系pH=7.4, 野生型和突變型精氨酸酶Ⅰ的濃度均為0.06U/mL, 底物L(fēng)-Arg濃度為25mmol/L, 測定不同L-Val濃度下的酶促反應(yīng)速率.

3結(jié)果與討論

3.1野生型和突變型精氨酸酶Ⅰ的分子動力學(xué)模擬

Fig.2　RMSD curve(A) and amino acid RMSD(B) of W-ArginaseⅠand R-ArginaseⅠ

Fig.3　Structure of W-Arginase Ⅰ and R-Arginase Ⅰ The secondary structure of W-ArginaseⅠ and R-Arginase Ⅰ is shown by ribbon model, the 156I of W-Arginase Ⅰ is shown by tube model, the 156R of R-Arginase Ⅰ is shown by ball-stick model.

Fig.4　Relationship between the initial reactionrate and the concentration of L-Vala. W-Arginase Ⅰ; b. R-Arginase Ⅰ.

經(jīng)過50ns的分子動力學(xué)模擬, 野生型(W)和突變型(R)精氨酸酶Ⅰ的蛋白主鏈的均方根偏差(RMSD)曲線見圖2(A). 野生型和突變型精氨酸酶Ⅰ均在30ns后達(dá)到平衡狀態(tài), 二者RMSD值在0.15～0.17nm之間. 結(jié)合圖2(B)可知, 點(diǎn)突變對精氨酸酶Ⅰ的整體結(jié)構(gòu)沒有影響. 野生型(W)和突變型(R)精氨酸酶Ⅰ的重疊結(jié)構(gòu)展示在圖3中. 分子動力學(xué)模擬平衡后二者的三維結(jié)構(gòu)幾乎重合, 圖3中球棒模型展示的156R側(cè)鏈伸展到空穴的內(nèi)部, 使得突變型(R)精氨酸酶Ⅰ的C2空穴容積明顯縮小, 由野生型的3.74×10-3nm3縮小到1.4×10-3nm3, 降低了L-Val結(jié)合在空穴C2的機(jī)率.

3.2L-Val對野生型和突變型精氨酸酶Ⅰ活性的影響

通過測定不同濃度L-Val存在時酶催化反應(yīng)的初始速率, 可以得到L-Val對野生型和突變型精氨酸酶Ⅰ活力的影響, 結(jié)果見圖4. L-Val對野生型和突變型精氨酸酶Ⅰ的酶促反應(yīng)都具有抑制作用, 并且這種抑制作用隨著L-Val濃度的增加而逐漸增強(qiáng). 當(dāng)L-Val濃度小于0.6mmol/L時, L-Val對野生型和突變型精氨酸酶Ⅰ活力的抑制程度差別不大, 而當(dāng)L-Val濃度大于0.6mmol/L時, L-Val對野生型精氨酸酶Ⅰ活力的抑制程度明顯大于對突變型精氨酸酶Ⅰ活力的抑制程度, L-Val濃度為4mmol/L時, 野生型精氨酸酶Ⅰ的活力下降約60%, 而突變型精氨酸酶Ⅰ的活力只下降約35%, L-Val對野生型精氨酸酶Ⅰ的半抑制濃度(IC50)為3.06mmol/L, 而對突變型精氨酸酶Ⅰ的IC50為6.26mmol/L.

在L-Val低濃度(<0.6mmol/L)時, L-Val對野生型和突變型精氨酸酶的C2空穴的結(jié)合率都很低, L-Val只能與底物競爭結(jié)合在活性口袋C1, 這時L-Val與酶接近以摩爾比1∶1結(jié)合. 在此濃度范圍內(nèi), L-Val對野生型和突變型精氨酸酶的抑制程度一致.

隨著L-Val濃度的上升, L-Val對野生型精氨酸酶Ⅰ的C2空穴的結(jié)合率升高, L-Val可以同時結(jié)合在活性口袋C1和空穴C2, 協(xié)同抑制酶的活性, L-Val與酶逐漸接近以摩爾比2∶1結(jié)合. 而對于突變型精氨酸酶Ⅰ而言, 因?yàn)橥蛔儗?dǎo)致突變型精氨酸酶Ⅰ的空穴C2容積明顯縮小, 削弱了L-Val與C2位點(diǎn)的親和力, 并且L-Val與C2位點(diǎn)的結(jié)合率未隨著L-Val濃度的上升而升高, 或升高程度不及野生型精氨酸酶Ⅰ, L-Val只能(或主要)與底物競爭結(jié)合在活性口袋C1, 無法實(shí)現(xiàn)雙L-Val分子協(xié)同抑制酶的活性作用, 因此L-Val對野生型精氨酸酶Ⅰ活力的抑制程度明顯大于對突變型精氨酸酶Ⅰ活力的抑制程度. 另外, 空穴C2是圖1中Loop圍成的區(qū)域, 并通過α螺旋H1與空穴C1(即活性口袋)相聯(lián), 而組氨酸(His)141是精氨酸酶催化機(jī)制的關(guān)鍵氨基酸, 它位于空穴C1內(nèi), 并且在α螺旋H1的末端. 如果L-Val結(jié)合在C2位點(diǎn), L-Val則可能通過干擾H1的結(jié)構(gòu), 改變His141側(cè)鏈咪唑基在活性中心的空間位置, 進(jìn)而影響酶的催化反應(yīng), 使酶活下降. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, L-Val對精氨酸酶Ⅰ催化精氨酸水解反應(yīng)具有明顯的抑制作用, 并且對野生型精氨酸酶Ⅰ的抑制程度明顯大于對突變型精氨酸酶Ⅰ的抑制程度, 而分子動力學(xué)模擬顯示空穴C2內(nèi)的點(diǎn)突變對酶整體構(gòu)象特別是活性口袋的構(gòu)象沒有明顯干擾, 僅縮小了空穴C2的體積, 降低了L-Val在空穴C2的結(jié)合率, 因此可以推斷精氨酸酶Ⅰ可能存在一個位于空穴C2的調(diào)節(jié)位點(diǎn), 而且L-Val可以結(jié)合于此位點(diǎn), 協(xié)同抑制酶的活性.

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(Ed.:Y,Z)

doi:10.7503/cjcu20160007

收稿日期:2016-01-05. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-04-15.

中圖分類號O641

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

MolecularDynamicsSimulationoftheInhibitionAgainstArginaseΙCatalyzedReactionbyL-Val

HUANGYiling,GAOXuefeng*

(College of Life Sciences, Jilin University, Changchun 130012, China)

AbstractMolecular dynamics simulation and mutation were used to get the influence at activity and kinetics of enzyme catalyzed reaction by L-Val on W-Arginase Ι and R-Arginase Ι. There is a big cavity C2 near the activity pocket of Arginase Ι. The result of molecular dynamics simulation shows that the mutation of Ile156Arg narrows the cavity volume of C2. The experimental result shows that influenced by L-Val the half maximal inhibitory concentration(IC50) of R-Arginase Ι has been risen obviously, the IC50by 3.06 mmol/L rises to 6.26 mmol/L. Therefore, Arginase Ι does exist a regulatory site in C2 and L-Val can combine on this site to disturb the activity of Arginase Ι.

KeywordsArginase Ι; Molecular dynamics simulation; Mutation; Half maximal inhibitory concentration(IC50); Regulatory site; L-Val

聯(lián)系人簡介: 高雪峰, 男, 博士, 副教授, 主要從事生物大分子體系的計(jì)算模擬研究.E-mail:gaoxf@jlu.edu.cn