慢性阻塞性肺疾病模型大鼠骨骼肌中Calpains的表達

劉待見，馮慧芬，劉劍波#

1)鄭州大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450014　2)鄭州大學第五附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052

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慢性阻塞性肺疾病模型大鼠骨骼肌中Calpains的表達

劉待見1)，馮慧芬2)，劉劍波1)#

1)鄭州大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 4500142)鄭州大學第五附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052

摘要目的：探討Calpains在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠骨骼肌萎縮中的作用。方法：40只健康雄性Wistar大鼠隨機分為COPD模型組及對照組，模型組采用氣管內(nèi)注入脂多糖加香煙煙霧染毒法建立大鼠COPD模型，HE染色法觀察肺組織及骨骼肌(趾長伸肌、膈肌)組織的病理學改變；分別采用免疫組化和RT-PCR法測定骨骼肌組織中Calpains(μ-Calpain和m-Calpain)蛋白及mRNA的表達。結(jié)果：在COPD模型組大鼠觀察到骨骼肌萎縮，對照組大鼠未見骨骼肌萎縮。與對照組比較，COPD模型組大鼠趾長伸肌及膈肌中μ-Calpain和m-Calpain蛋白及m-Calpain mRNA表達增強(P<0.05)，而μ-Calpain mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論：Calpains在COPD模型大鼠骨骼肌中表達上調(diào)，可能參與COPD模型大鼠骨骼肌萎縮。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系統(tǒng)常見病，病變主要累及肺臟，也可引起全身不良效應(yīng)[1]，其中骨骼肌(包括膈肌)萎縮是重要表現(xiàn)之一，嚴重影響患者生活質(zhì)量及預(yù)后。目前發(fā)現(xiàn)多種代謝途徑通過肌纖維降解、肌細胞凋亡[2]或壞死參與骨骼肌萎縮，其中Ca2+依賴蛋白酶途徑(Calpains途徑)是重要調(diào)節(jié)機制之一，Calpains途徑中的核心成員μ-Calpain和m-Calpain能夠降解骨骼肌中的肌原纖維蛋白和骨架蛋白[3]，參與肌細胞凋亡和壞死，介導(dǎo)多種病理情況下的骨骼肌萎縮。但兩者是否參與COPD骨骼肌萎縮仍不清楚，為此，作者建立大鼠COPD模型，通過檢測μ-Calpain和m-Calpain在趾長伸肌和膈肌中的表達，研究Calpains與COPD骨骼肌萎縮的關(guān)系，探索COPD骨骼肌萎縮的發(fā)生機制。

1材料與方法

1.1材料紅旗渠牌香煙(尼古丁1.0 mg/支，焦油12 mg/支)購自河南中煙安陽卷煙廠；脂多糖(LPS)購自Sigma公司；μ-Calpain和m-Calpain兔抗鼠單克隆抗體、生物素標記羊抗兔單克隆抗體、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及辣根酶標記鏈酶卵白素均購自南京建成生物技術(shù)有限公司；Trizol購自Invitrogen有限公司。

1.2實驗動物分組及模型建立40只10周齡健康雄性清潔級Wistar大鼠(河南省實驗動物中心)，體重197.8～246.1(228.7±17.0) g，采用隨機數(shù)字表法分為COPD模型組和對照組各20只，適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠7 d，模型組在第1天和第14天氣管內(nèi)注入LPS(配制質(zhì)量濃度1 g/L，每只大鼠灌注200 μg)，第2～13天及15～28天行紅旗渠牌香煙煙霧暴露，2次/d，每次持續(xù)0.5 h。對照組在模型組氣管內(nèi)注入LPS當天以相同術(shù)式氣管內(nèi)注入等體積注射用生理鹽水，余不做任何干預(yù)。

1.3標本收集及預(yù)處理造模成功后腹腔麻醉，腹主動脈抽血法處死大鼠，快速分離大鼠右側(cè)趾長伸肌及膈肌，分別分成兩部分，一部分投入液氮罐中凍存以備RT-PCR檢測，另一部分置于40 g/L多聚甲醛液固定，待病理學及免疫組化檢測。40 g/L多聚甲醛液注入右心室灌注雙肺，直到雙肺完全變白，于右肺垂直于支氣管的矢狀面最大周徑處取材，放入40 g/L多聚甲醛液固定24 h以上。

1.4大鼠肺組織及骨骼肌組織病理檢測將固定完成的肺組織和骨骼肌組織進行石蠟包埋切片，HE染色后電子顯微鏡下觀察組織病理學改變。

1.5大鼠骨骼肌中μ-Calpain和m-Calpain蛋白表達的測定采用免疫組化SP法。操作嚴格按試劑盒說明書進行。骨骼肌中μ-Calpain和m-Calpain蛋白陽性反應(yīng)產(chǎn)物均呈棕色顆粒狀，每例骨骼肌標本各取4張陽性切片，每張切片選取5個視野，采用計算機多功能真彩圖像分析系統(tǒng)(CMIAS)進行圖像分析和數(shù)據(jù)處理,計算陽性細胞的平均灰度值。

1.6大鼠骨骼肌中μ-Calpain和m-Calpain mRNA表達的測定采用RT-PCR測定μ-Calpain和m-Calpain mRNA的表達水平，以β-actin為內(nèi)參，嚴格遵照試劑盒說明操作。μ-Calpain上游引物序列5’-TCCCTCTGCAAACCAAAGTACA-3’，下游引物序列5’-ACTGCACTGAAACATGGGACCT-3’，擴增產(chǎn)物大小為207 bp。β-actin上游引物序列5’-ATCAT GTTTGAGACCTTCAACA-3’，下游引物序列5’- CATCTCTTGCTCGAAGTCTA-3’，擴增產(chǎn)物大小為388 bp。m-calpain上游引物序列5’-CATTTGACT GACCAACTGAGCC-3’,下游引物序列5’-ACGTTTG GAAGTGGATAAGGCA-3’，擴增產(chǎn)物大小為188 bp。產(chǎn)物經(jīng)20 g /L瓊脂糖凝膠電泳后置于暗箱式紫外透射儀中成像，掃描圖像，輸入計算機，應(yīng)用專業(yè)凝膠圖像分析處理軟件測定其灰度值，結(jié)果均以β-actin為對照，計算灰度比值。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0 進行分析。經(jīng)方差齊性檢驗后，應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗比較COPD模型組和對照組大鼠骨骼肌中Calpains蛋白及mRNA表達水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.1模型評價COPD模型組大鼠皮毛黃澀，反應(yīng)遲鈍，活動減少及有咳嗽、喘息、臥底弓背等呼吸困難表現(xiàn)。對照組動物毛色有光澤，反應(yīng)靈敏，活動自如。造模結(jié)束當天，COPD模型組大鼠體重(257.0±18.9) g，對照組為(282.0±16.0) g，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.515，P<0.001)。

2.2兩組大鼠肺組織病理學改變模型組大鼠支氣管黏膜結(jié)構(gòu)紊亂，部分纖毛柱狀上皮細胞缺失，柱狀上皮細胞纖毛減少、粘連、倒伏，杯狀上皮細胞顯著增生；黏膜下層、肌層及細支氣管周圍有大量炎性細胞浸潤，淋巴細胞為主；肺泡上皮細胞部分缺失，肺泡壁變薄，部分斷裂，肺泡腔膨大，大小不均，形狀不規(guī)則，部分損毀融合成大皰(圖1A)。對照組大鼠支氣管黏膜結(jié)構(gòu)完整，纖毛柱狀上皮細胞排列整齊，杯狀細胞無增生；肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔大小均勻一致(圖1B)。

A：模型組；B：對照組。圖1　兩組大鼠肺組織病理結(jié)果(HE,×200)

2.3兩組大鼠骨骼肌組織病理學改變見圖2。模型組大鼠趾長伸肌及膈肌肌纖維排列紊亂、松弛，形態(tài)干癟，局部有斷裂，胞核排列紊亂，大小不一(圖2A1、A2)。對照組大鼠骨骼肌肌纖維染色均勻，形態(tài)飽滿，排列整齊，胞核規(guī)則排列于肌膜下，大小一致(圖2B1、B2)。

A：模型組；B：對照組；1: 趾長伸肌；2：膈肌。圖2　兩組大鼠骨骼肌組織病理學變化(HE,×200)

2.4兩組大鼠骨骼肌中μ-Calpain和m-Calpain蛋白的表達見圖3、表1。

A：模型組；B：對照組；1: μ-Calpain蛋白；2：m-Calpain蛋白。圖3　兩組大鼠膈肌(上排)和趾長伸肌(下排)中Calpain蛋白的表達(SP，×400)

μ-Calpain和m-Calpain棕色顆粒主要集中在骨骼肌細胞胞質(zhì)中，在間質(zhì)內(nèi)皮細胞及血管壁平滑肌細胞亦呈陽性表達。在模型組大鼠骨骼肌中，μ-Calpain和m-Calpain蛋白表達呈強陽性；對照組骨骼肌中見少量μ-Calpain表達陽性的棕色顆粒沉著，未見m-Calpain陽性染色。

2.5兩組大鼠骨骼肌中μ-Calpain和m-Calpain mRNA的表達見圖4、表2。

表1　兩組大鼠骨骼肌中μ-Calpain和m-Calpain蛋白的表達(n=20)

圖4　兩組大鼠膈肌(上排)和趾長伸肌(下排)中Calpain mRNA的表達

表2　兩組大鼠骨骼肌中μ-Calpain和m-Calpain mRNA的表達(n=20)

3討論

骨骼肌萎縮作為COPD主要的肺外不良效應(yīng)，在COPD患者中普遍存在，與病死率高度相關(guān)[4]。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，骨骼肌萎縮最終取決于三個方面：蛋白質(zhì)分解代謝增加，蛋白質(zhì)合成代謝減少及肌細胞壞死和凋亡增加，其中蛋白質(zhì)分解增加及合成減少是萎縮的主要原因。早在1992年，Koohmaraie[7]已經(jīng)證明Calpains途徑作為骨骼肌蛋白分解代謝的起始因子，通過降解結(jié)蛋白等肌纖維骨架蛋白，破壞肌小節(jié)結(jié)構(gòu)，釋放肌絲，啟動肌纖維蛋白降解過程，同時激活其他蛋白降解途徑，引起肌肉萎縮。Calpastatin為Calpains的專一性、內(nèi)源性抑制劑，有研究[8]顯示，過表達Calpastatin，同時耗竭細胞內(nèi)ATP，能夠減少肌纖維蛋白降解，從反面論證Calpains參與肌原纖維蛋白降解。另一項研究[9]同樣發(fā)現(xiàn)抑制Calpains活性，可抑制骨骼肌中纖維蛋白和骨架蛋白的降解，更進一步證實Calpains可促進骨骼肌萎縮。有學者[10-11]通過顯微鏡觀察到萎縮的骨骼肌纖維中存在纖維蛋白和骨架蛋白降解，肌小節(jié)完整性破壞，Z線結(jié)構(gòu)扭曲，抑制Calpains活性能夠減輕上述病理變化。還有研究[12-13]證實在COPD、類風濕關(guān)節(jié)炎、糖皮質(zhì)激素、去神經(jīng)、失重、燒傷等介導(dǎo)的病理性骨骼肌萎縮中，Calpains介導(dǎo)肌細胞凋亡，促進骨骼肌萎縮；Calpains還通過參與肌纖維壞死過程，促進肌營養(yǎng)不良綜合征及少肌癥發(fā)病[14-15]。

以上研究證實Calpains能夠降解骨骼肌中的肌原纖維蛋白和骨架蛋白，參與肌細胞凋亡和壞死，介導(dǎo)多種病理情況下的骨骼肌萎縮。但Calpains是否參與COPD骨骼肌萎縮鮮見報道。該研究主要觀察COPD大鼠骨骼肌病理改變及Calpains在COPD大鼠骨骼肌中的表達情況，結(jié)果顯示：與對照組相比，COPD模型組大鼠存在骨骼肌萎縮，并在萎縮的骨骼肌中存在μ-Calpain和m-Calpain蛋白及m-Calpain mRNA的高表達，提示μ-Calpain和m-Calpain可能參與COPD骨骼肌萎縮，但具體機制有待進一步實驗研究。此外，該研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：對照組和COPD模型組大鼠骨骼肌中均見μ-Calpain蛋白表達，且在COPD模型組中的表達水平較對照組明顯增加，推測μ-Calpain可能在生理情況下可發(fā)揮調(diào)節(jié)骨骼肌代謝的作用，病理情況下被異常激活，促進骨骼肌萎縮；而m-Calpain蛋白及mRNA在對照組大鼠骨骼肌中表達極少，在模型組表達明顯增加，提示m-Calpain主要在COPD病理情況下促進大鼠骨骼肌萎縮。

綜上說明，Calpains在COPD大鼠骨骼肌中表達增加，可能參與了COPD骨骼肌萎縮，但具體機制有待進一步明確。

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(2015-09-23收稿責任編輯趙秋民)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.026

#通信作者，男，1964年2月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：慢性氣道炎癥性疾病，E-mail：jbliuzz@126.com

中圖分類號R365

關(guān)鍵詞慢性阻塞性肺疾??；骨骼肌萎縮；Calpain；大鼠

Expression of Calpains in skeletal muscle of rat COPD model

LIU Daijian1)，F(xiàn)ENG Huifen2)，LIU Jianbo1)

1)DepartmentofRespiratoryDiseases,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500142)DepartmentofInfectiousDiseases,theFifthAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsCOPD；skeletal muscle atrophy；Calpain;rat

AbstractAim: To study the role of Calpains in rat skeletal muscle atrophy of chronic obstructive pulmonary disease (COPD).Methods: Forty healthy male Wistar rats were randomly allocated into COPD group and control group. COPD model was established by dripping lipopolysacharide(LPS) into trachea and exposing to cigarettes smoking.The pathological changes of lung tissue and skeletal muscle were observed by HE staining. Immunohistochemistry and RT-PCR were performed respectively to determine protein and mRNA expression of Calpain in skeletal muscle(μ-Calpain and m-Calpain).Results: Skeletal muscle atrophy was observed in COPD group instead of control group.Compared with control group,the expression of μ-Calpain and m-Calpain protein in extensor digitorum longus muscle and diaphragm of COPD group was enhanced (P<0.05), as well as m-Calpain mRNA expression(P<0.05).Conclusion: The expression of Calpains in skeletal muscle of rats COPD model upregulated. Calpains may be involved in COPD skeletal muscle atrophy.