Th17細胞及IL-17在卵巢癌患者外周血中的表達及臨床意義

張　蓉,梅　紅,聶亞紅,馬艷輝*

(青島市中心醫(yī)院 1.檢驗科;2.超聲科,山東 青島266042)

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Th17細胞及IL-17在卵巢癌患者外周血中的表達及臨床意義

張蓉1,梅紅2,聶亞紅1,馬艷輝1*

(青島市中心醫(yī)院 1.檢驗科;2.超聲科,山東 青島266042)

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是女性常見的惡性腫瘤之一，死亡率占婦科腫瘤首位，已成為女性惡性腫瘤中威脅最大的疾病。目前，研究的熱點主要集中在腫瘤與機體免疫系統(tǒng)的關(guān)系，以及如何發(fā)揮機體免疫抗腫瘤功效等方面[1]。輔助性T細胞17(Th17)是獨立于Th1和Th2細胞的CD4+T細胞亞群，它特異性地分泌IL-17、IL-21和IL-22。Th17細胞及其細胞因子在胃癌、乳腺癌、前列腺癌中發(fā)生發(fā)展過程具有重要的調(diào)控作用[2,3]。臨床研究證實，Th17細胞及其細胞因子白細胞介素-17(IL-17)在多種腫瘤患者的腫瘤組織及外周血中高表達，促進腫瘤局部微血管的生成，進而誘導腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移[4,5]。

本研究采用流式細胞術(shù)和ELISA方法通過檢測卵巢癌患者外周血中Th17細胞含量及血清中IL-17表達變化，分析其與卵巢癌患者病理特征之間的關(guān)系，旨在探討Th17細胞及IL-17在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的免疫學作用。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2013年1月-2015年1月青島市中心醫(yī)院收治的卵巢癌患者女性60例。以此為實驗組。入組標準：所有患者手術(shù)前均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療，均獲得經(jīng)病理學和影像學確診。其中年齡范圍37-78歲，平均58±10.2歲；有吸煙史21例，無吸煙史39例；臨床分期(以美國癌癥聯(lián)合委員會制定的TNM分期為標準)：Ⅰ期9例，Ⅱ期18期，Ⅲ期20例，Ⅳ期13例；病發(fā)位置分為單側(cè)組、雙側(cè)組。單側(cè)組35例，雙側(cè)組25例。對照組選取同期來本院體檢的健康女性志愿者60例，年齡33-76歲，平均59.4±8.7歲，均排除各臟器病變，無感染性疾病或自身免疫性疾病等。所有患者及志愿者均知情同意。兩組年齡等一般資料無顯著差異，具有可比性。

1.2標本采集

采集實驗組和對照組受檢者手術(shù)前清晨空腹靜脈血3 ml兩管，其中一管血樣于室溫下自然凝集30 min，3 500×g離心15 min，收集血清，置于-20℃冰箱中保存待檢。

1.2.1細胞分析采用流式細胞儀檢測外周血中Th17的數(shù)量。具體地，每孔加入外周單個核細胞(PBMC)1×105個(體積0.1 mL)，然后分別加入1 μg/mL Ionomycin和25 ng/mL PMA各20 μL，再加入10 μg/mL BFA 20 μL，放置于37℃、5%CO2孵箱中孵育4 h。加入FITC-Anti-Human CD3、APC-Anti-Human CD8室溫避光孵育30 min，固定破膜后加入PE-Anti-Human-IL-17，室溫避光孵育30 min，加入PBS使細胞重懸后上機檢測。

1.2.2細胞因子分析采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定IL-17含量：按照試劑說明書操作，將標準品按濃度配置制成梯度標準品，依次加入反應孔中，和樣品加入相應板孔中，設置陰性對照。37℃孵育1 h，加入洗液清洗3次；加生物標記素后孵育1 h，加入洗液清洗3次；加入HRP酶溶液孵育45 min后加入洗液清洗2次；加入顯色液、終止反應，室溫孵育15 min，在10 min內(nèi)測定在波長450 nm/620 nm吸光度值。

1.3主要試劑和儀器

Ionomycin、PMA、BFA、FITC-Anti-Human CD3、APC-Anti-Human CD8和PE-Anti-Human-IL-17抗體均購自美國BD公司。Anti-Human-IL-17 ELISA試劑盒購自R&D公司。RP-MI1640、D-hank’s緩沖液均購自Hyclone公司。淋巴細胞分離液購自MP Biomedicals公司。流式細胞儀為BD Accuri C6(USA，BD)。

1.4統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1OC組與對照組外周血Th-17細胞含量及IL-17水平的比較

通過FCM檢測OC組與對照組外周血Th-17細胞含量，結(jié)果表明OC組外周血Th-17細胞比例顯著高于對照組(P<0.01)，通過ELISA檢測得到，OC組外周血IL-17水平顯著高于對照組(P<0.01)，見表1。

表1　　　　OC患者與正常對照組外周血Th17細胞及IL-17

注：與對照組比較，**P< 0.01。

2.2OC患者Th-17細胞及IL-17水平與臨床病理特征的關(guān)系

通過統(tǒng)計分析得出，OC患者處于Ⅲ - Ⅳ期時，其血清Th17細胞和IL-17水平明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者，差異極顯著(P<0.01)?；颊吣挲g、 吸煙史、分化級別和病發(fā)位置等病理特征與外周血Th17細胞及IL-17水平無明顯相關(guān)性,見表2。

表2　OC患者外周血Th17細胞及IL-17水平與臨床病理特征關(guān)系

注：與Ⅰ-Ⅱ期患者相比，**P< 0.01。

3討論

近年來，探索腫瘤與微環(huán)境之間的相互作用，成為主要的研究熱點。腫瘤微環(huán)境中存在諸多的細胞因子，它們通過參與和調(diào)控局部效應細胞功能障礙、促進抑制性細胞因子功能以及淋巴細胞的免疫負調(diào)節(jié)等作用促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，前列腺癌、胰腺癌患者的外周血中，Th17細胞百分比和IL-17水平明顯高于正常人[6]。在肝癌、結(jié)腸癌、NSCLC等患者的腫瘤組織取樣檢測發(fā)現(xiàn)，其Th17細胞所占比例明顯高于其他自身正常組織[7-9]。

Th17細胞屬于CD4+T細胞亞型，由IL-6和TGF-β誘導分化[10]，通過釋放IL-17實現(xiàn)其生物學效應。而IL-17通過上調(diào)成纖維細胞、間質(zhì)細胞的血管內(nèi)皮生長因子，誘導血管生成，以此促進腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移[11]。本研究結(jié)果表明，與正常對照組相比，OC患者外周血中Th17細胞和IL-17水平明顯升高，隨著臨床分期的增加，Ⅲ-Ⅳ期OC患者外周血Th17細胞的含量明顯上升(P<0.01)，IL-17的水平越高(P<0.01)，與報道相一致。這表明，Th17細胞可能直接參與了OC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲，在腫瘤的病理進展中促進其向中后期發(fā)展，其機制可能與IL-17介導的VEGF相關(guān)信號通路有關(guān)，如CXCL1、CXCL5等血源性因子可促進腫瘤內(nèi)微血管的顯著增加，利于腫瘤的生長和浸潤[12]。

綜上，Th17作為新型的輔助型T細胞，通過分泌炎癥性細胞因子IL-17在OC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用，Th17可能成為OC患者生存期和死亡率的重要指標之一。進一步探討Th17細胞和IL-17在OC患者免疫調(diào)節(jié)過程中的作用及機制，可為探索OC的免疫學診斷和干預靶點奠定理論基礎。

參考文獻：

[1]Govindaraj C,Scalzo-Inguanti K,Madondo M,et al.Impaired Th1 immunity in ovarian cancer patients is mediated by TNFR2+ Tregs within the tumor microenvironment[J].Clin Immunol,2013,149(1):97.

[2]Gnerlich JL,Mitchem JB,Weir JS,et al.Induction of Th17 cells in the tumor microenvironment improves survival in a murine model of pancreatic cancer[J].The Journal of Immunology,2010,185(7):4063.

[3]Karabulut S,Afsar ?U,Karabulut M,et al.Evaluation of Serum Interleukin-17 (IL-17) Levels as a Diagnostic Marker in Pancreatic Adenocarcinoma[J].Journal of gastrointestinal cancer,2015:1.

[4]Chen WC,Lai YH,Chen HY,et al.Interleukin-17-producing cell infiltration in the breast cancer tumour microenvironment is a poor prognostic factor[J].Histopathology,2013,63(2):225.

[5]Numasaki M,Watanabe M,Suzuki T,et al.IL-17 enhances the net angiogenic activity and in vivo growth of human non-small cell lung cancer in SCID mice through promoting CXCR-2-dependent angiogenesis[J].The Journal of Immunology,2005,175(9):6177.

[6]Sfanos K S,Bruno TC,Maris CH,et al.Phenotypic analysis of prostate-infiltrating lymphocytes reveals TH17 and Treg skewing[J].Clinical Cancer Research,2008,14(11):3254.

[7]Chen X,Wan J,Liu J,et al.Increased IL-17-producing cells correlate with poor survival and lymphangiogenesis in NSCLC patients[J].Lung cancer,2010,69(3):348.

[8]Zhang JP,Yan J,Xu J,et al.Increased intratumoral IL-17-producing cells correlate with poor survival in hepatocellular carcinoma patients[J].Journal of hepatology,2009,50(5):980.

[9]Liu J,Duan Y,Cheng X,et al.IL-17 is associated with poor prognosis and promotes angiogenesis via stimulating VEGF production of cancer cells in colorectal carcinoma[J].Biochemical and biophysical research communications,2011,407(2):348.

[10]Kimura A,Naka T,Kishimoto T.IL-6-dependent and-independent pathways in the development of interleukin 17-producing T helper cells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2007,104(29):12099.

[11]Muranski P,Boni A,Antony P A,et al.Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma[J].Blood,2008,112(2):362.

[12]Kryczek I,Wei S,Zou L,et al.Cutting edge:Th17 and regulatory T cell dynamics and the regulation by IL-2 in the tumor microenvironment[J].The Journal of Immunology,2007,178(11):6730.

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)07-1103-03

作者簡介：張蓉(1970-),女,山東青島人,青島市中心醫(yī)院檢驗科主管檢驗師,研究方向：臨床檢驗。

(收稿日期：2015-06-08)