原發性免疫性血小板減少癥患者外周血IL-23p19基因表達及意義

錢　琤,司　宇,徐貴霞,葉　辛,谷明莉,任傳路,吳天勤*,鄧安梅*

(1.解放軍第100醫院，江蘇 蘇州215007；2.第二軍醫大學附屬長海醫院，上海200433)

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原發性免疫性血小板減少癥患者外周血IL-23p19基因表達及意義

錢琤1,司宇2,徐貴霞2,葉辛2,谷明莉2,任傳路1,吳天勤1*,鄧安梅2*

(1.解放軍第100醫院，江蘇 蘇州215007；2.第二軍醫大學附屬長海醫院，上海200433)

摘要：目的研究IL-23p19在原發性免疫性血小板減少癥(Primary immune thrombocytopenia，ITP)患者外周血單個核細胞中的表達及意義。方法采用實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測了55例ITP和35例健康對照外周血單個核細胞(PBMC)中IL-23p19基因表達量，分析ITP患者IL-23p19基因表達與疾病分期、血小板數及細胞因子的相關性。結果ITP患者外周血PBMC 中IL-23p19基因表達較健康對照明顯增高，且慢性ITP和難治性ITP IL-23p19基因表達均高于新診斷期，難治性ITP高于持續性ITP；ITP患者IL-23p19表達與PLT呈負相關，與IL-17水平呈正相關，與IFN-γ、IL-4、IL-10無相關性。結論IL-23p19基因在ITP中表達升高，IL-23表達異常與ITP發病密切相關。

關鍵詞：原發性免疫性血小板減少癥；白介素23 p19；自身免疫性疾病

(ChinJLabDiagn,2016,20:1068)

原發免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一種以血小板減少為特點的獲得性自身免疫性疾病，以出血為主要臨床表現。其經典機制認為是由于自身抗體致敏的血小板被單核-巨噬細胞系統過度破壞所致。近年來研究發現，除體液免疫外，細胞免疫在ITP的發病中亦起著重要作用。ITP患者出現Th1細胞極化，Th17細胞增加，某些相關的細胞免疫效應分子的表達也出現異常[1]。

IL-23作為IL-12 細胞因子家族的新成員，由IL-23p19 和 IL12p40 組成異源二聚體分子。IL-23具有十分復雜的生物學功能，在抗感染免疫、抗腫瘤免疫以及自身免疫病的發病中發揮著重要的作用[2]。本研究用實時熒光定量PCR方法檢測ITP患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)IL-23p19基因的表達情況，并分析在疾病不同時期IL-23p19表達情況與血小板計數及細胞因子表達的相關性，以期為臨床診斷及治療提供新的線索。

1對象與方法

1.1對象2013年-2014年間在我院就診ITP 患者共55例，其中男性25例，女性30例，平均年齡35歲(16-60)歲，包括16例新診斷的ITP、12例持續性ITP、20例慢性ITP、7例難治性ITP患者，診斷標準參照成人原發免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識(修訂版)[3]。35例正常體檢志愿者為健康對照組。本研究經過倫理委員會批準，所有受試對象均簽署知情同意書。

1.2血樣標本的采集與PBMC的分離采集空腹靜脈血5 ml，置于枸櫞酸鈉抗凝劑的無菌試管中。采用密度梯度離心法分離PBMC(sigma)。

1.3RNA抽提與反轉錄采用Trizol法抽提細胞總RNA，將其反轉錄為cDNA，-20℃冰箱備用。細胞總RNA 抽提試劑盒Invitrogen公司及逆轉錄試劑盒Applied Biosystems公司。

1.4定量PCR采用Taqman探針技術以18s rRNA 為內參將逆轉錄得到的cDNA模板進行PCR擴增。IL-23p19引物序列為：上游5′- CAGCTTCATGCCTCCCTACTG -3′下游5′AGGCTTGGAATCTGCTGAGTCT-3’, 探針FAM-AACTCCTGCAGCCTGA-MGB；內參18s RNA 上游5′- ACATCCAAGGAAGGCAGCAG -3′;下游5′-TTCGTCACTACCTCCCCGG-3′;FAM-CGCGCAAATTACCCACTCCCGA-TAMRA。 PCR反應條件為：50℃ 2 min,95℃ 10 min隨后95℃ 15 S，60℃ 1 min循環45次。讀取每個定量PCR反應的閾循環(CT)值后，將定量PCR結果以2-ΔΔCT表示。ΔΔCT =[ΔCT (患者) ]-[ΔCT(對照) ],ΔCT = [CT(靶基因)]-[CT(管家基因)] 。

1.5臨床實驗室指標的檢測采用Sysmex XN-1000全血細胞計數儀測定血小板(PLT)計數。

1.6血清細胞因子的檢測IL-17、IFN-γ、IL-4、IL-10和濃度測定根據ELISA試劑盒操作說明進行測定。

1.7統計學處理采用graphpad prism5.0統計軟件進行統計學分析,兩組之間比較采用Student’s t檢驗，多組資料的比較采用方差分析檢驗，相關性分析采用Pearson法，以P<0．05為差異有統計學意義。

2結果

2.1ITP患者PBMC中IL-23p19表達

結果顯示，與正常對照組相比，ITP患者中PBMC IL-23 p19 mRNA表達量顯著增高(fold= 8.32，t=13.36，P<0.0001)， 差異有統計學意義，見圖1A。

2.2ITP患者PBMC中IL-23p19mRNA分期表達結果

不同分期的ITP患者IL-23p19基因表達有差異(P<0.05)，相對表達量分別為新診斷6.50±2.60 ；持續性7.033±2.54；慢性9.58±2.86；難治性11.11±3.56，見圖1B。與新診斷ITP相比，慢性ITP和難治性ITP IL-23p19基因表達均升高(新診斷ITP vs 慢性ITP，q=4.616，P<0.05) 新診斷ITP vs 難治性ITP，q=5.120，P<0.01)；與持續性ITP相比，難治性ITP表達升高(q=4.319，P<0.05)。

A． ITP與正常健康對照組IL-23mRNA表達 *P<0.001與健康對照比較；B． ITP不同分期IL-23mRNA表達 *P<0.05，與新診斷ITP比較；**P<0.05，與持續性ITP比較

圖1不同組別外周血單個核細胞IL-23mRNA表達

2.3ITP患者外周血PBMC中IL-23p19表達與PLT及細胞因子的相關性分析

ITP患者PBMC 中IL-23p19與PLT呈負相關(r=-0.4070，P<0.01)，見圖2A；與血清IL-17呈正相關(r=0.446 3，P<0.01)，見圖2B，IL-23p19 mRNA的表達量與IFN-γ、IL-4、IL-10等不相關。

A IL-23p19mRNA表達與血小板計數的相關性分析B IL-23p19mRNA表達與的血清IL-17表達相關性分析

3討論

ITP是一種常見的出血性自身免疫性疾病，以血清中出現抗血小板抗體為特征，臨床上出現由于免疫功能異常紊亂導致的出血癥狀。近年研究表明，細胞免疫功能異常在疾病致病過程中發揮重要作用，包括B細胞、 T細胞、樹突狀細胞免疫功能異常，而其中T細胞介導的免疫反應在ITP的發病過程中起到至關重要的作用[4]。

IL-23是異二聚體分子，除了與IL-12共用一個亞基p40外，自己還有獨特的亞基IL-23p19。內皮細胞和 B細胞、T細胞、MΦ和DC都能表達p19 mRNA[5]。盡管IL-23與IL12的結構類似，但功能并不完全相同，IL-12主要是促使Th0向Th1分化，而IL-23主要作用于記憶T細胞，促進其分化。研究發現在自身免疫性疾病模型EAE和RA中IL12 促進了幼稚T細胞的分化，而IL-23是在最后階段介導炎癥反應的關鍵效應因子[6]。IL-23表達增多參與多種自身免疫性疾病，如類風濕性關節炎[7]、多發性硬化[8]、炎癥性腸病[9]等。本研究檢測了ITP 患者及健康對照組外周血PBMC IL-23p19mRNA的表達，結果發現與正常對照組相比，ITP患者PBMC中IL-23 p19mRNA表達量顯著增高，差異有統計學意義，說明IL-23p19的表達增高與ITP的發病密切相關。我們進一步研究了不同疾病分期IL-23p19mRNA的表達，發現慢性期和難治性表達均高于新診斷期，難治性ITP高于持續性ITP，表明IL-23p19 mRNA表達水平在疾病早期低表達，隨著疾病的進一步發展，進入到疾病后期明顯升高，分析原因可能是由于ITP后期以炎癥反應為主，高表達的IL-23p19主要在疾病的后期促炎癥反應中發揮效應。

患者外周血PLT計數，可以在一定程度上反映出ITP的嚴重程度和疾病的進展狀況，本研究發現IL-23p19基因表達與PLT計數呈負相關，表明IL-23p19可以成為評價疾病嚴重程度的潛在指標之一。本研究還發現，IL-23p19與IL-17表達具有相關性，這可能是由于IL-23通過與IL-23R結合，促進IL-23R細胞內酪氨酸殘基磷酸化，導致STAT3磷酸化，進入細胞核，促進T細胞活化為Th17細胞，從而釋放IL-17，導致血清IL-17表達增高。

本實驗建立了IL-23p19基因表達的實時熒光定量RT-PCR方法，首次從分子水平證實了IL-23p19基因在ITP患者中的表達增高，提示IL-23p19與ITP的發生發展存在一定相關性，IL-23p19基因表達為ITP的臨床診斷及治療提供了新的思路。

參考文獻：

[1]Kistangari G, McCrae KR. Immune thrombocytopenia[J].Hematol Oncol Clin North Am,2013,27(3):495.

[2]Lankford CSI,Frucht DM.A unique role for IL-23 in promoting cellular immunity[J].J Leukoc Biol,2003,73:49.

[3]中華醫學會血液學分會血栓與止血學組．成人原發免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識(修訂版)[J]．中華血液學雜志, 2011，32(3)：214．

[4]Semple JW, Provan D.The immunopathogenesis of immune thrombocytopenia:T cells still take center-stage[J].Curr Opin Hematol,2012,19:357.

[5]Duvallet E, Semerano L, Assier E, et al. Interleukin-23:a key cytokine in inflammatory diseases[J].Ann Med,2011,43(7):503.

[6]Cua DJ, Sherlock J, Chen Y,et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain[J].Nature,2003,421(6924):744.

[7]Abu Al Fadl EM,Fattouh M, Allam AA.High IL-23 level is a marker of disease activity in rheumatoid arthritis[J].Egypt J Immunol,2013,20(2):85.

[8]Li Y,Chu N,Hu A,et al.Increased IL-23p19 expression in multiple sclerosis lesions and its induction in microglia[J].Brain,2007,130(Pt 2):490.

[9]Fransen K, van Sommeren S, Westra HJ,et al.Correlation of genetic risk and messenger RNA expression in a Th17/IL-23 pathway analysis in inflammatory bowel disease[J].Inflamm Bowel Dis,2014,20(5):777.

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃(973)項目(2013CB531606)；國家自然科學基金(81471605，81401358)；南京軍區重點基金項目(15ZD009)；南京軍區面上項目(14MS026)

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)07-1068-04

中圖分類號：Q786

文獻標識碼：A

作者簡介：錢琤(1978-)，女，醫學博士，主治醫師，主要從事自身免疫病及機制研究。司宇(1990-)，女，在讀研究生，主要從事自身免疫病研究，為共同第一作者。

(收稿日期：2015-03-26)

Expression of IL-23p19 in perpheral blood of patients with primary immune thrombocytopenia

QIANCheng1,SIYu2,XUGui-xia2,etal.

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,No.100HospitalofPLA,JiangsuSuzhou215007,China;2.LaboratoryDiagnostics,ShanghaiChanghaiHospital,Shanghai200433,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of IL-23p19 in perpheral blood of patients with primary immune thrombocytopenia (ITP) and its clinical significance.MethodsThe real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR) was used to determine the expression of IL-23p19 mRNA in the peripheral blood of 55 ITP patients and 35 healthy controls . The correlations between the expression of IL-23p19mRNA and the staging,platelet counts,serum cytokine concentrations of ITP patients were analyzed statistically.ResultsThe IL-23p19 mRNA level in PBMC of ITP was significantly higher than those in healty controls. Afterwards, higher levels of IL-23mRNA were found in patients with chronic ITP and refractory ITP than in patients with newly diagnosed ITP. Compared to persistent ITP, refractory ITP patients had increased IL-23p19mRNA levels.The IL-23p19 mRNA level in ITP patients were negatively correlated with the platelet counts, positively correlated with IL-17 in ITP patients,and there was no association with IFN-γ, IL-4 and IL-10. ConclusionThe IL-23p19 gene expression of PBMC in ITP patients is significantly elevated, indicating that IL-23 play an important role in the pathogenesis of ITP.

Key words:primary immune thrombocytopenia，refractory;IL-23p19;Autoimmue diseases