HGF對AngII介導的腎小管上皮細胞轉分化的影響及相關信號轉導通路的研究

王紅月，劉　麗，張　洋，顧春梅

(吉林大學第一醫院 腎內科，吉林 長春130021)

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HGF對AngII介導的腎小管上皮細胞轉分化的影響及相關信號轉導通路的研究

王紅月，劉麗，張洋，顧春梅*

(吉林大學第一醫院 腎內科，吉林 長春130021)

摘要：目的探討肝細胞生長因子(HGF)對血管緊張素II(AngII)介導的腎小管上皮細胞轉分化(TEMT)的影響以及是否與信號轉導和基因轉錄激活子(STAT3)信號轉導通路有關。方法體外培養人近曲小管上皮細胞并分為4組，即對照組，AngII(AngII:10-6mol/L)組，HGF(HGF:8 μg)組，AngII(AngII:10-6mol/L)+HGF(HGF:8 μg)組，用RT-PCR的方法檢測4組中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及β-actin的mRNA表達,用Western方法檢測4組中P-STAT3及β-actin的蛋白表達。結果與對照組相比，HGF組α-SMA mRNA表達減少,P-STAT3 蛋白表達下降，AngII組與之相反；與AngII 組比較，AngII+HGF組α-SMA mRNA表達減少，P-STAT3蛋白表達下降。結論HGF可抑制AngII介導的腎小管上皮細胞轉分化，且此作用可能通過對STAT3信號轉導通路的抑制而達到的。

關鍵詞：肝細胞生長因子；腎小管上皮細胞轉分化；血管緊張素II；α-平滑肌肌動蛋白；STAT3信號通路

(ChinJLabDiagn,2016,20:1058)

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF),是一種重要的抗腎間質纖維化因子，新近發現，HGF可通過腎小管上皮-肌成纖維細胞轉分化(tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation,TEMT)而防止腎臟纖維化[1]。TEMT致其增殖能力加強，并產生大量間質成分，α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是判定是否存在TEMT的重要物質。轉化生長因子-β1(TGF-β1)被認為是重要的促進TEMT因子，在近期的研究中發現，血管緊張素II(AngII)也是很強的致TEMT因子[2]，且HGF抗TEMT作用可能與AngII相關[3]，Janus酪氨酸蛋白激酶/信號轉導和基因轉錄激活子(JAK/STAT3)信號途徑可發揮信號轉導和基因轉錄活化子蛋白的雙重作用，介導多種細胞因子和生長因子的細胞內信號轉導過程并活化相應靶基因，從而產生生物學效應。我們實驗的目的是探討HGF是否抑制AngII介導的腎小管上皮細胞轉分化，以及此作用是否與STAT3信號通路有關。

1材料與方法

1．1腎小管上皮細胞培養人近曲小管上皮細胞 (HK-2,Human kidney proximaltubular cells-2)購自中國生命科學院上海細胞庫。HK-2細胞用含有10% RPMI-1640胎牛血清的培養液培養。

1.2分組以每孔1×103細胞接種于96孔板中，腎小管上皮細胞分4組：對照組，AngII 組，HGF組，AngII+HGF組。對照組只加腎小管上皮細胞，HGF及AngII組在細胞的基礎上分別加入HGF(8 μg)及AngII(AngII:10-6mol/L)，AngII+HGF組在細胞基礎上同時加HGF(8 μg)及AngII(AngII:10-6mol/L)。24 h后收集細胞進行檢測。

1.3α-SMA mRNA的表達采用RT-PCR法檢測,首先用Trizol法提取總RNA,鑒定，合成cDNA,計算RNA的濃度。PCR擴增α-SMA基因，β-actin為內參。α-SMA正義鏈 5′-ACTGGGACGACTAGGAAAAAG-3′，反義鏈 5′-CATCTCCAGAGTCCAGCACA -3′，退火溫度42°C，30個循環，產物240bp；β-actin正義鏈 5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACAC -3′，反義鏈 5′-CATGGTGGTGCCGCCAGACAG -3′，退火溫度56℃，30個循環，產物552 bp。PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳后，用Phoretix ID凝膠圖像分析軟件測定電泳條帶的吸收度，用內參校準。

1.4用Western印記法檢測將細胞加入細胞裂解緩沖液，離心，提取總蛋白，測定蛋白含量電泳、移膜，封閉。 加入一抗、二抗室溫孵育1 h。晾干拍照。應用ECL化學發光試劑在X線膠片上曝光、顯影和定影。測定α-SMA及P-STAT3蛋白表達條帶的灰度值，用β-actin作為內參，計算比值。

2結果

4組α-SMA的m-RNA表達圖譜見圖1A)，4組α-SMA的基因表達的光密度值標準化半定量分析見圖1B)。可以看出，與對照組相比，HGF組α-SMA表達下降(P<0.05)，AngII組α-SMA表達上調(P<0.01);與AngII組比較，AngII+HGF組α-SMA表達減少(P<0.05)。

注：A) 4組α-SMA的m-RNA表達,B) 4組α-SMA的m-RNA表達光密度值標準化分析。*與對照組相比，P<0.05，**P<0.01；#與AngII組相比P<0.05。

圖14組α-SMA的m-RNA表達及光密度值標準化分析

4組P-STAT3的蛋白表達圖譜見圖2 A)，4組P-STAT3的蛋白表達的光密度值標準化半定量分析見圖2 B)。可以看出，與對照組相比，HGF組P-STAT3表達下降(P<0.01)，AngII組P-STAT3表達上調(P<0.01)；與AngII 組比較，AngII+HGF組P-STAT3表達減少(P<0.01)。

注：A) 4組P-STAT3蛋白表達,B) 4組P-STAT3蛋白表達光密度值標準化分析。*與對照組相比，P<0.05；**P<0.01；##與AngII組相比P<0.01。

圖24組P-STAT3蛋白表達及光密度值標準化分析

3討論

近期的研究提示，腎間質纖維化很大程度上是由于TEMT而引起的[4]，HGF有逆轉TEMT的作用[1]，但關于其機制目前尚不明確，可能與對TGF-β1的抑制有關，還有一些線索提示與AngII有關[3]。

JAK/STAT信號途徑介導多種細胞因子細胞內信號轉導而調控細胞增殖、分化、凋亡、免疫調節等過程，P-STAT是STAT磷酸化形式，是有活性形式。其在糖尿病腎病、梗阻性腎病中起重要作用[5]。有實驗認為，AngII可以通過激活JAK2/STAT3通路進一步上調TGF-β1、CTGF等細胞因子及細胞外基質成分FN的表達，提示AngII可能通過激活JAK2/STAT3通路參與腎纖維化的發病過程[6]，我們在培養的腎小管上皮細胞中，就TEMT、AngII及HGF的關系進一步研究，并探討STAT3信號通路是否參與HGF抗TEMT的過程。

我們的研究結果顯示，與對照組相比，HGF組α-SMA的mRNA表達減少，AngII組α-SMA的mRNA表達增多，說明HGF可從基因水平上抑制腎小管上皮細胞α-SMA的表達，即可抑制TEMT，與既往研究結果一致。而AngII可促進α-SMA的mRNA表達，促進TEMT，兩者作用相反。與單獨應用AngII對比，同時加入HGF和AngII時，α-SMA的mRNA表達減少，由此可推斷HGF抑制α-SMA的mRNA表達可能與對AngII的抑制有關。

在P-STAT的蛋白表達分析中，我們看四組中，與對照組相比，HGF組P-STAT的蛋白表達減少，AngII組P-STAT的蛋白表達增多，說明HGF可從蛋白水平上抑制P-STAT通路，且與AngII作用相反，與單獨應用AngII對比，HGF和AngII組P-STAT蛋白表達減少，提示我們HGF抑制AngII介導腎小管上皮細胞轉分化，這種作用可能通過對P-STAT信號通路的抑制而達到的。下一步需要探索HGF與JNK-2等信號通路的關系。

參考文獻：

[1]Hong-yue Wang,Li-zhi Yang,Ming-ji Cui,et al.Hepatocyte growth factor-induced amelioration in chronic renal failure is associated with reduced expression of α-smooth muscle actin[J].Renal Failure,2012,34(7):862.

[2]Chen J,Chen JK,Harris RC.Angiotensin II induces epithelial -to to mesenchymal in renal epithelial cells through reactive oxygen species/Src/caveolin-mediated activation of an epidermal growth factor receptor-tracellular signal- regulated kinase signaling pathway[J].Mol Cell Biol,2012,32(5)981.

[3]Hong-yue Wang,Yan-jun Wang,Ming-ji Cui,et al.Hepatocyte growth factor-induced amelioration in renal interstitial fibrosis is associated with reduced expression of α-smooth muscle actin and transforming growth factor-β1[J].Indian Journal of Biochemistry & Biophysics,2011,48:308.

[4]Liu Y.New insight into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2010,21:212.

[5]Pang M,Ma L,Gong R,et al.A novel STAT3 inhibitor,S3I-201,attenuates renal interstitial fibroblast activation and interstitial fibrosis in obstructive nephropathy[J].Kidney Int,2010,78(3):257.

[6]LI Yan-nong，FAN Qiu-ling，WANG Li-ning.Significance of JAK2/STAT3 in angiotensin II up-regulation of TGF-β1、CTGF and FN mRNA expression On mesangial cells under hyperglucose[J].J Nephrol Dialy Transplant,2009,18(1):44.

基金項目:吉林大學第一醫院二部科研基金 (B007)

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)07-1058-03

中圖分類號：Q816

文獻標識碼：A

(收稿日期：2015-03-20)

The Effects of Hepatocyte Growth Factor on Tubular Epithelial-myofibroblast Transdifferentiation That Angiotensin II Took Part In and The Associated Study About Signaling Pathway

WANGHong-yue，LIULi，ZHANGYang，etal.

(DepartmentofNephrology,FirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo inquire the effects of hepatocyte growth factor (HGF) on tubulapithelial-myofibroblast transdifferentiation (TEMT) that Angiotensin II (Ang II) took part in,and the associated study about STAT3 signaling pathway.MethodsHK-2 cells were cultured in RPMI-1640 medium containin,and the cells were divided into four groups:control，AngII(AngII:10-6mol/L) group，HGF(HGF:8 μg)group，AngII(AngII:10-6mol/L)+HGF(HGF:8 μg)group.α-smooth muscle actin (α-SMA)，and β-actin mRNA expressions were detected by RT-PCR,P-STAT3 and β-actin protein expressions were detected by Western.Resultsα-SMA mRNA expression was reduced and STAT3 protein expression were reduced in HGF group compared to control.But α-SMA mRNA expression,STAT3 protein expression were elevated in AngII group.α-SMA mRNA,STAT3 protein expression were all released in AngII+HGF group compared to AngII group.ConclusionHGF can restrain TEMT that Ang II took part in,and this effect maybe realized by inhibiting STAT3 signaling pathway.

Key words:Hepatocyte growth factor;Tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation;Angiotensin II;α- smooth muscle actin;STAT3 signaling pathway