華蟾素對人腦膠質瘤細胞SHG44增殖的影響

潘心瑤 王成德 黃佩雷 潘進錢★

華蟾素對人腦膠質瘤細胞SHG44增殖的影響

潘心瑤 王成德 黃佩雷 潘進錢★

目的 探討華蟾素對人腦膠質瘤細胞SHG44增殖、凋亡的影響及其機制。方法 不同濃度華蟾素分別作用于SHG44細胞株，MTT法及流式細胞技術檢測其對SHG44細胞株增殖的影響和對細胞周期的影響；（AO/EB）雙重染色及透射電鏡觀察SHG44細胞株形態學變化和超微結構的改變；Westernblot技術檢測Caspase8蛋白及Bcl-2的表達。結果 1μg/ml和10μg/ml濃度下的華蟾素顯著抑制人腦膠質瘤細胞SHG44增殖作用（P＜0.05），并呈濃度和時間依賴性。FCM檢測發現華蟾素可使人腦膠質瘤細胞SHG44的G0/G1期細胞明顯增多（P＜0.05），可見凋亡峰；Western Blot檢測顯示華蟾素作用可使Caspase8蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調。結論 華蟾素能夠誘導Caspase8和Bcl-2的差異性表達，具有抑制人腦膠質瘤細胞SHG44的細胞增殖，促進其凋亡的作用。

華蟾素 腦膠質瘤 細胞周期 細胞凋亡

腦膠質瘤為腦實質惡性腫瘤，發病率約5～10/10萬，預后較差［1］。目前臨床上以手術治療為主，常難以切除徹底。目前化療在腦膠質瘤的治療中作用越來越重要，但化療藥物均有較大毒副作用，且存在耐藥現象，因此急需找到一種抑瘤效果好，副作用小的新型化療藥物。華蟾素具有不良反應少、療效明確效的優點，臨床上廣泛應用肝癌、肺癌等的輔助治療［2～4］。本文通過研究華蟾素對腦膠質瘤細胞SHG44生物學影響，探討其抑瘤機制，為腦膠質瘤的輔助治療提供理論依據。

1　 材料與方法

1.1 一般材料 美國gibco公司的標準胎牛血清、DMEM培養基；安徽淮北金蟾藥業公司生產的華蟾素注射液，與DMEM培養基混合配制成不同濃度的華蟾素藥液，作用時間及濃度參照參考文獻［5］；美國Sigma公司的四甲基偶氮唑藍（MTT）、碘化丙啶（PI）、吖啶橙（AO）、二甲亞砜（DMSO）溴乙啶（EB）；美國SantaCruz公司的GAPDH抗體、二抗、Caspase8、Bcl-2。熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。本院生物研究中心實驗室提供人腦膠質瘤SHG44細胞株，于DMEM培養基中（含100U/ml青霉素、10%胎牛血清）常規培養。

1.2 方法 （1）MTT比色法檢測華蟾素對人腦膠質瘤細胞SHG44存活率的影響：將人腦膠質瘤細胞SHG44培養至對數生長期，取對數生長期細胞按照104個/每孔接種于96孔培養板中，并將其分為3組，細胞培養箱內放置24h后，分別向各組加入不同濃度的華蟾素（10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml），分別作用24h及72h；對照組為由單純DMEM培養基上培養的人腦膠質細胞瘤細胞SHG44。在實驗結束前于每孔中分別加入MTT（5g/L）20μl，振蕩使其充分混勻，繼續細胞箱內孵育4h后擯棄上清液，每孔內分別加入二甲基亞砜（DMSO）150μl，振蕩1min，測定每孔490nm波長處吸光度（A值），并根據公式計算細胞存活率：細胞存活率=（實驗組吸光度/對照組吸光度）×100%。（2）流式細胞術（FCM）檢測華蟾素對人腦膠質瘤細胞SHG44周期及凋亡的影響：取對照組細胞及3組不同濃度華蟾素細胞，冷磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗滌2次，加入冷乙醇（70%）固定細胞、4℃下過夜。1000r/min轉速離心10min后，摒棄上清液，加入RNaseA（200ug/ ml）和TritonX-100各200ul，37℃下放置15min，再加入熒光染料PI（100μg/ml）1ml，暗處室溫下放置15min，應用流式細胞儀進行檢測（熒光檢測：發射波長670nm，激發波長490nm）。根據公式計算細胞凋亡情況：凋亡指數（APO）=（出現凋亡的細胞數/檢測到的細胞數）×100%。（3）透射電鏡（TEM）觀察人腦膠質瘤細胞SHG44的超微結構改變：胰酶消化并獲得所需細胞，1000r/min離心10min，擯棄上清液后冷卻臺上（4℃）預冷，固定2h（25g/L的戊二醛），磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，餓酸（10g/L）固定，梯度酒精脫水，常規包埋、聚合、切片、鉛染、透射電鏡觀察。（4）吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙重染色觀察細胞形態學變化：取對照組細胞及3組加入不同濃度華蟾素的細胞，將培養基吸去，分別向每孔加入吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）混合染色液10μl：100μg/ mlEB與100μg/ml AO等量混合均勻。靜置10min后在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞的形態學變化。（5）Western Blot檢測：取對照組細胞及3組不同濃度華蟾素細胞，RIPA裂解液（含1% PMSF）提取細胞總蛋白，BCA法測定樣品蛋白含量，磷酸鹽緩沖液調整蛋白終濃度至1μg/μl，12%SDS-PAGE電泳，電轉移至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉（TBST 溶解）封閉2h，放入相應的Caspase8（1∶1000）、兔抗人Bcl-2，孵育過夜（4℃），加入堿性磷酸酶（ALP）標記的二抗（羊抗兔）孵育2h（室溫），ECL發光液顯色，暗室曝光并拍照。經專業圖像分析軟件（Image-Pro Plus） 處理蛋白條帶，通過光密度量化分析。

2　 結果

2.1 華蟾素對人腦膠質瘤細胞SHG44 存活率的影響 SHG44細胞株接受不同濃度華蟾素處理24h、72h后發現：隨著華蟾素的濃度增加和時間延長，SHG44細胞株的存活率呈現逐漸降低趨勢，其作用具有劑量和時間的依懶性，劑量越大，時間越長，抑制作用越顯著（F1=4.011，P＜0.01；F1=4.324，P＜0.01）。在10μg/ml、1μg/ml濃度的華蟾素處理下，SHG44細胞生長受到明顯抑制（P＜0.05）；0.1μg/ml濃度的華蟾素細胞毒作用不明顯（P＞0.05）。見表1。

表1 不同濃度華蟾素對人腦膠質瘤細胞SHG44的存活率影響（±s）

表1 不同濃度華蟾素對人腦膠質瘤細胞SHG44的存活率影響（±s）

華蟾素（μg/ml）　24h　72h A490nm 值　　存活率（%）　A490nm 值　　存活率（%）0.1　0.780±0.090　95.48　1.089±0.057　95.33 1.0　0.570±0.068　68.92　0.679±0.033　60.98 10.0　0.277±0.041　34.66　0.172±0.024　17.47對照組　0.809±0.079　　…　1.133±0.044　　…F值　4.011　-　4.324　-P值　P＜0.01　-　P＜0.01　-

2.2 華蟾素對人腦膠質瘤細胞SHG44凋亡率及細胞周期的影響 （1）華蟾素濃度越高，SHG44細胞株凋亡率越高（F=12.331，P＜0.01）；在10μg/ml、1μg/ml濃度的華蟾素作用下，SHG44細胞株凋亡率顯著升高（P＜0.05）。（2）在10μg/ml、1μg/ml濃度的華蟾素作用下，S期和G2/M期的SHG44細胞數明顯減少，細胞被阻滯于G0/G1期，不能向S期過渡，從而抑制細胞的分裂，出現典型凋亡峰。見表2。

表2 不同濃度華蟾素對人腦膠質瘤SHG44細胞周期及凋亡率影響（±s）

表2 不同濃度華蟾素對人腦膠質瘤SHG44細胞周期及凋亡率影響（±s）

華蟾素（μg/ml）　凋亡率（%）　　細胞周期（%）G0/G1　S　G2/M對照組　0.90±0.31　51.66±2.20　35.28±2.22　13.68±1.65 0.1　1.12±0.28　55.32±1.68　31.47±1.62　12.78±1.22 1.0　12.11±2.52　70.08±4.14　23.89±3.33　6.10±0.79 10.0　27.04±5.26　85.26±4.34　13.76±1.32　4.66±0.41 F值　12.331　12.604　11.594　10.594 P值　　＜0.01　　＜0.01　　＜0.01　　＜0.01

2.3 透射電鏡觀察SHG44細胞超微結構改變 對照組（單純DMEM培養基）人腦膠質瘤細胞SHG44呈卵圓型，邊緣可見少量微絨毛，細胞質內可見線粒體峭，細胞核核仁清晰，染色質無異常。10μg/ml濃度的華蟾素作用72h后，可見SHG44細胞邊緣突出，凋亡小體可見，表面包裹細胞膜，凋亡小體內可見殘存的細胞器和細胞核。染色質濃集成團塊狀。見圖1。

2.4 吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙重染色觀察SHG44細胞凋亡 對照組（單純DMEM培養基）未見明顯凋亡的細胞。實驗組（加入不同濃度華蟾素）可見早期凋亡細胞：吖啶橙（AO）染色下細胞核呈黃綠色熒光，濃聚成顆粒狀，位于細胞的一側。部分晚期凋亡細胞核為EB染色呈桔紅色，濃聚和偏向；少數細胞核碎裂成塊狀。見圖2。

圖1 透射電鏡下細胞超微結構的改變

圖2 AO/EB染色觀察細胞凋亡

2.5 Western Blot檢測Caspase8蛋白、Bcl-2表達情況 10μg/ml、1μg/ml濃度的華蟾素作用48h后，實驗組SHG44細胞的Caspase8蛋白表達較對照組升高（422±37）%、（149±17）%，差異有統計學意義（P＜0.01）。10μg/ml、1μg/ml濃度的華蟾素作用48h后，實驗組SHG44細胞的Bcl-2蛋白表達較對照組下降（391±24）%、（172±18）%，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

3　 討論

由于腦膠質瘤的侵襲性生長，其治療一直是臨床上的一個難題［6］。近年來某些傳統中醫藥材因為毒性低、來源廣、療效可，逐漸開始成為臨床上腫瘤治療的一個新的手段。華蟾素為復方注射制劑，主要成分為吲哚類生物堿及蟾蜍毒精等，具有止痛、消炎、提高免疫力等作用。有研究表明［7～10］，華蟾素對如前列腺癌、骨肉瘤、乳腺癌等腫瘤細胞具有誘導分化和凋亡的作用，具有不良反應小，安全有效的優點。但其對于腦膠質細胞瘤的相關作用缺乏相關報道，因此，作者進行一系列華蟾素對人腦膠質細胞瘤SHG44作用的相關研究，旨在華蟾素在腦膠質細胞瘤治療中的應用提供一定的理論和指導。

本資料顯示，華蟾素對膠質瘤細胞具有抑制其生長的作用，10μg/ml濃度的華蟾素作用24h人腦膠質瘤細胞SHG44后其生長抑制率達72.23%，作用72h 達82.8%，其抑制作用具有劑量和時間的依賴性。為進一步探討其抑制細胞生長的機制，作者應用FCM技術檢測不同濃度華蟾素對SHG44細胞株細胞周期分布及凋亡及的影響發現，華蟾素作用于細胞72h后，S期及G2/M期的細胞明顯減少，而G0/G1期細胞明顯增加，細胞阻滯于G0/G1期從而有絲分裂受到影響，細胞生長受到抑制，并形成典型的亞G1峰。且在AO/ EB雙重染色熒光顯微鏡下觀察到典型凋亡細胞的形態學改變，透射電鏡進一步觀察到凋亡細胞的超微結構改變。有研究表明［11］，華蟾素能將腫瘤細胞的細胞周期阻滯在S期，因此達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。因此作者推測，華蟾素通過抑制SHG44細胞株的細胞周期進程，誘導細胞凋亡，從而抑制細胞增殖。

細胞凋亡指為更好的適應環境細胞自身發出的一個由基因控制的自主有序死亡的過程，其在腫瘤細胞的生長過程發揮著重要作用［12］。Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡的效應期的調節過程中發揮著重要作用。Bcl-2蛋白家族根據其功能可分為兩類蛋白亞群［13］：一類為促進凋亡蛋白（如Bik/Nbk、Bcl-Xs、Bak、Bax等）；另一類為抑制凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xY、Mcl-1、Bcl-xL等）。Bcl-2蛋白家族可通過影響線粒體巨孔的形成抑制細胞色素C（Cyt c）的釋放，從而抑制細胞凋亡，同時其還可通過抑制凋亡誘導因子（AIF）抑制細胞的凋亡［14］。另外，Bcl-2蛋白可通過調節線粒體及內質網中的鈣離子濃度，來保持胞內鈣離子的動態平衡，從而避免線粒體中Ca2+濃度過高引發的細胞凋亡。Caspase8為Fas介導的細胞凋亡過程中的一個重要啟動因子，其細胞凋亡過程有賴于一類對天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）產生的級聯反應。Caspase8被切割激活后，可通過對下游的靶蛋白進行水解，產生細胞凋亡效應。本資料中，通過Western Blot檢測發現，1μg/ml、10μg/ml濃度的華蟾素作用48h后可使Caspase8蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調。因此作者推測，華蟾素通過抑制上調Caspase8蛋白表達，下調Bcl-2蛋白表達來誘導人腦膠質瘤細胞SHG44凋亡，從而抑制其增殖。

1 Rees JH. Diagnosis and treatment in neuro-oncology： an oncological perspective . Br J Radiol， 2011， 84（2）： S82～S89.

2 宋科官，張濤，嚴峰，等.華蟾素和順鉑對骨肉瘤MG－63細胞聯合殺傷作用的研究.中國骨與關節雜志，2014，3（3）：224～229.

3 田莉莉，高山，崔曉楠.華蟾素注射液對人肝癌HepG－2細胞增殖與凋亡及拓撲異構酶II的影響.中國臨床藥理學，2014，29（7）：530～533.

4 Qi F， Li A， Inagaki Y， et al. Chinese herbal medicines as adjuvant treatment during chemo- or radio-therapy for cancer . Biosci Trends，2010， 4（6）：297～307.

5 叢子翔.Ras/Raf/Mek/Erk信號通路在膠質瘤中的研究進展.中國微侵襲神經外科雜志，2012，17（9）：430～432.

6 曾戲，宋光福，董自強.蟾蜍制劑誘導腫瘤細胞凋亡的研究進展.現代腫瘤醫學，2012，20（4）：865～867.

7 劉英姿，張磊，單保恩，等.白細胞介素24對大鼠腦膠質瘤細胞Survivin表達的影響.中國微侵襲神經外科雜志，2011，16（4）：177～179.

8 李宏良，曾榮香，田華琴，等.華蟾素聯合MPT方案治療多發性骨髓瘤療效觀察.中華全科醫學，2010，8（2）：169～171.

9 Wang DL， Qi FH， Xu HL， et al. Apoptosis - inducing activity of compounds screened and characterized from cinobufacini by bioassayguided isolation .Mol Med Rep，2010，3（4）： 717～722.

10 于秀月，孔垂澤，張哲，等.CDC25B在腎癌細胞中的作用，現代腫瘤醫學，2014，22（8）：1782～1785.

11 .叢子翔.Ras/Raf/Mek/Erk信號通路在膠質瘤中的研究進展.中國微侵襲神經外科雜志，2012，17（9）：430～432.

12 Hu M， Wang B， Qian D， et al. Interference with ATF5 function enhances the sensiti vity of human pancreatic cancer cells to paclitaxelinduced apoptosis . Anticancer Res， 2012， 32（10）： 4385～4394.

13 Miguel-Hidalgo JJ， Paul IA， Wanzo V， et al. Memantine prevents cognitive impairment and reduces Bcl-2 and caspase 8 immunoreactivity in rats injected with amyloid β1-40 . Eur J Pharmacol， 2012， 692（1-3）： 38～45.

14 Yamasaki Y， Yamasaki M， Tachibana H， et al. Important role of β1-integrin in fucoidan-induced apoptosis via caspase-8 activation . Biosci Biotechnol Biochem，2012，76（6）： 1163～1168.

Objective To explore the influence of cinobufotalin on the proliferation and apoptosis of human glioma cell line SHG44 and its mechanism. Methods Different concentrations cinobufotalin were applied to SHG44 cell line，MTT assay cinobufacini on SHG44 cell line proliferation； fl ow cytometry cinobufacini SHG44 cell line for cell cycle； TEM ultrastructural changes SHG44 cell plant type，（AO / EB） double staining morphological changes； Westernblot Caspase8 to detect Bcl-2 protein and the expression. Results Cinobufotalin （1μg/ml and 10μg/ml concentration） inhibited human glioma cells SHG44 proliferation（P＜0.05），and in a dose and time dependent. FCM detected that cinobufotalin make human glioma cells SHG44 the G0 / G1 phase cells increased signifi cantly（P＜0.05），and can see the apoptotic peak； Western Blot test showed cinobufotalin role in bringing Caspase8 protein upregulation，Bcl-2 protein was down-regulated. Conclusion Cinobufotalin can induce differential expression of caspase 8 and Bcl-2，and play the role in inhibiting proliferation of tumor cells and accelerating apoptosis of SHG44 cells.

Cinobufotalin Glioma Cell cycle Apoptosis

325000 溫州醫科大學第一臨床醫學院（潘心瑤）325000 溫州醫科大學附屬第一醫院神經外科（王成德黃佩雷 潘進錢）
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1.3 統計學方法 采用SPSS17.0軟件。計量資料用（±s）表示，同一個指標不同組之間的比較及各組間的兩兩比較采用方差分析；同指標兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。